周清华教授：肺癌侵袭转移的逆转研究进展
天津医科大学总医院 天津市肺癌研究所 周清华
肺癌转移是肺癌的恶性标志和生物学特征，也是导致肺癌病人治疗失败和死亡的主要原因。肺癌侵袭转移是一个极其复杂的多基因、多因子共同调控的多阶段、多步骤过程。阐明肺癌侵袭转移的分子机理，寻找逆转和/或阻止肺癌侵袭转移的分子靶点，是21 世纪肺癌研究的热点和前沿，也是人类战胜肺癌的希望所在。本文拟就近年来肺癌侵袭转移的逆转研究进展介绍如下。
一、 以肺癌侵袭转移相关分子为靶点的逆转
意大利学者Sacchi 等报告制备出一种鼠肺癌相关抗原单抗35-13c，用该单抗处理高转移和低转移潜能的Lewis 肺癌细胞株，以研究该抗体对Lewis 肺癌生长和转移扩散能力的影响。研究结果发现蕾？期35-13c处理Lewis肺癌后，其扩散转移潜能的改变与肺癌细胞表面MHC抗原和TSP-180 蛋白表达有密切关系。给Lewis肺癌荷瘤鼠注射135-13c单抗或在接种Lewis肺癌细胞株前注射135-13c单抗可逆转高转移潜能Lewis肺癌的转移扩散能力。
尿激酶纤溶酶原激活酶(uPA)和尿激酶纤溶酶原激活酶受体(UPAR)在肿瘤侵袭转移中的作用近年来受到关注。抑制肿瘤细胞膜表面的尿激酶-尿激酶纤溶酶原激活酶受体可能具有抗肿瘤侵袭转移的作用。Zhu 等应用Western blot 和RT-PCR 检测人高转移肺大细胞癌细胞株(PG)，发现该细胞株高表达uPA 和UPAR。于是合成人尿激酶纤溶酶原激活酶氨基端片段(ATF)，并将该片段转染PG肺癌细胞株。ATF为一包含有完整的UPAR 结合位点序列，但不具催化功能。应用3H-胸苷掺合实验和细胞生长曲线实验显示ATF 表达并不影响转染细胞株的细胞增殖分裂。扫描电镜结果显示ATF 转染细胞株从典型的侵袭表型转变为非侵袭表型。Boyden小室实验结果显示ATF转染细胞株的侵袭转移能力显示降低。体内实验结果显示ATF 转染PG 肺细胞株移植瘤的肺转移率显著降低。因此，靶向阻断肺癌细胞膜表面的尿激酶纤溶酶原激活酶受体可逆转肺癌细胞的侵袭转移潜能。
转录因子核因子κB(NFκB)是另一个受关注的与肺癌侵袭转移有关的细胞靶点。Andela 等建立一株鼠肺泡细胞癌细胞株。通过逆转录病毒将显性负性NFκB抑制因子转染该细胞株，使该细胞株缺乏NFκB信号。实验结果发现阻断NFκB信号可导致MMP-9，尿激酶样纤溶酶原激活因子、肝素酶下调，TIMP-1、TIMP-2和纤溶酶原激酶因子抑制因子-2上调。阻断NFκB信号在体内外均不影响肿瘤细胞的增殖分裂，但在体内能阻止肿瘤细胞向血管的侵袭、鸡绒毛膜囊转移和动物体内的自发转移。NFκB在调控肺癌侵袭转移中起特殊的关键作用，作为抗肺癌侵袭转移的靶点具有临床前景。
二、 以“肺癌转移抑制级联”为靶点的逆转
周清华等在研究nm23-H1 基因表达、突变和缺失与肺癌侵袭转移和预后关系时发现，该基因蛋白、mRNA的低表达，等位基因缺失与肺癌的高转移和预后不良有密切关系，发现伴有nm23-H1 等位基因缺失的肺癌常伴有肺癌侵袭转移相关分子的表达异常，并提出了“肺癌转移抑制级联”的新概念和“肺癌转移抑制级联”是一个基因家族群，其中一些基因在这个“级联”中起正向调节作用，而另一些则起负向调节作用，正常这种正向和负向调节平衡的维持，肺癌才不发生远处转移，nm23-H1 基因在“肺癌转移抑制级联”中起关键和上游调节作用，nm23-H1 基因通过调控“肺癌转移抑制级联”表型的平衡，实现其肺癌转移抑制基因功能的新理论。
(一) nm23-H1 等位基因缺失人肺癌细胞株的筛选及鉴定
周清华等应用四川省重点实验室四川大学华西医院肺癌分子实验室构建的高转移人大细胞肺癌细胞株L9981 和低转移人大细胞肺癌细胞株L9980 研究，不同转移潜能人肺癌细胞中“肺癌转移抑制级联”的存在状态，nm23-H1 基因在“肺癌转移抑制级联”中的作用和地位，调控“肺癌转移抑制级联”的分子机理；以及以“肺癌转移抑制级联”为靶点的肺癌靶向治疗的可能性。周清华等从株人肺癌细胞株中筛选出高转移人大细胞肺癌细胞株L9981具有nm23-H1基因等位基因缺失，mRNA转录表达和蛋白表达缺失(图1-4)。
(二) 人高转移大细胞肺癌细胞株L9981 的体外侵袭力和远处转移能力
应用改良Boyden 小室法检测人高转移大细胞肺癌细胞株L9981 和人低转移大细胞肺癌细胞株NL9980 的体外侵袭力，发现L9981 的体外侵袭力显著高于NL9980 细胞株(图5)。
应用裸鼠移植瘤动物模型观察L9981 和NL9980 移植瘤远处转移能力发现L9981 组裸鼠均有肺部复发转移，而NL9980 组只有一只裸鼠在肺部出现一个转移灶。
(三) 人高转移大细胞肺癌细胞株L9981 转染nm23-H1 基因前后“肺癌转移抑制级联”相关基因转录表达水平的改变
应用DNA 重组技术构建nm23-H1-EGFP 重组质粒，应用脂质体法将nm23-H1-EGFP 质粒转染人高转移大细胞肺癌细胞株L9981，获得L9981-nm23-H1 转基因细胞株。该转基因细胞株能持续、稳定，高效地表达野生型nm23-H1 基因。
应用巢式RT-PCR，检测L9981 细胞株转染nm23-H1 基因前后“肺癌转移抑制级联”相关基因VEGF、CD44S、MMP-2、CD44V6、E-Cadherin、β-catenin、TIMP-1、C-Met 等基因的转录表达水平改变。观察到nm23-H1基因转染L9981细胞株后能显著上调“肺癌转移抑制级联”正性相关基因β-catenin、E-Cadherin、TIMP-1 和CD44s 基因的转录表达水平，显著下调“肺癌转移抑制级联”负性相关基因VEGF、CD44V6、MMP-2和C-Met基因的转录表达水平(表1、图6、7)。
编辑: blue 作者:丁香园通讯员
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