陈宝安教授：纳米技术在肿瘤多药耐药逆转中的应用
东南大学附属中大医院
陈宝安 孙茜
讲者孙茜
多药耐药(multidrug resistance，MDR)，是指由一种药物诱发，同时对其他孙和作用机理不同的多种抗肿瘤药物具有交叉耐药性。目前认为 MDR 是肿瘤细胞对化疗药物毒性损伤的最重要的自我保护防御机制，是肿瘤细胞耐药的常见形式，也是白血病化疗失败和复发的主要原因而成为当今肿瘤治疗的一大难题，据美国癌症协会估计，90%以上肿瘤患者死于不同程度的耐药。据此逆转肿瘤细胞的 MDR、提高化疗敏感性对恶性血液病治疗有积极意义。
另一方面，随着科学研究的深入和进展，人们对自然界的认识越来越趋于微观，生物科学也不例外：从器官、组织、细胞规模发展到以DNA、RNA为基础构建的分子水平，从而衍生出了纳米技术。当物质缩小到达纳米级的时候，由于表面原子空间排列的不同，物理和化学性质就会有根本性的改变，近几年有关纳米方面的研究突飞猛进。纳米(nanometer，nm)是指十亿分之一米，纳米技术(nanotechnology)是指度量范围在1.0～100.0nm内的物质或结构的制造技术。将纳米技术应用于诊断、治疗、监测以及控制生物系统则被称为"纳米医学"，在纳米医学中，有可能在有症状、用药之前检测到已知遗传缺陷而做出疾病诊断，精确靶向用药，并能以无创的影像工具显示疗效，所以欧洲科学基金会将纳米医学形象地描述为"一场医疗保健的变更"。
在纳米医学中，利用纳米载体聚合携载化疗药物的纳米技术是逆转肿瘤细胞MDR的一项探索性研究。已有不少文献成功报道通过制作不同的药物纳米粒以提高药物对肿瘤细胞的杀伤作用。各国政府近年都相继加大了对纳米医药研究的资助力度，我国的《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006～2020年)》也将纳米研究列入"重大科学研究计划"，成为未来15年我国引领未来发展、实现重点跨越的4个重中之重领域之一，并且占有很大比例。
一、载药纳米技术简介
纳米技术用于制药领域是临床中的最重要的应用，纳米药物新剂型研发是当今新药研究的前沿课题。利用纳米材料独特的性质制成药物或是作为药物的一种组分已成为新型的制药方法。如果以传统的口服或静脉方式给予一般药物治疗，由于吸收的不充分和血药浓度难以控制，则可能出现药效减低和毒副作用。纳米药物由于尺寸效应和表面效应，可能会产生新的生物活性。纳米颗粒有药物控释、药物靶向以及显著提高药物生物利用度等特性，大大克服了传统给药的弱点。当载药纳米粒静脉给药后，主要集中在单核巨噬细胞丰富的器官，尤其是肝、脾、骨髓。因而利用纳米粒体内分布特点，改变药物体内的分布，减少全身毒副作用，提高药物的生物利用度。
载药纳米复合物主要由骨架材料和化疗药物组成， 如果是磁性纳米复合物则尚需增加磁性材料。骨架材料有白蛋白、聚丙烯酸酯、葡聚糖、淀粉、磷脂酰胆碱、乙基纤维素等。常用的磁性材料有：(1)单体，如纯铁、钴、镍等；(2) 氧化物，如四氧化三铁、氧化钴等；(3)合金，如铁镍合金、铁铝合金等。常用化学共沉淀法、单体阴离子聚合法等制备磁性纳米颗粒；加热固化法、加交联剂固化法、聚合沉淀法等制备磁性微球；机械分散法、逆相蒸发法等制备磁性脂质体。载药纳米复合物则根据不同载体材料和化疗药物的性质选择并改良不同的方法，有：吸附法、包埋法、乳液聚合法、界面聚合法等。携载一种化疗药的载药纳米复合物的制备工艺日趋成熟，现在已有学者将两种药物：一种化疗药和一种多药耐药逆转剂共聚合于纳米材料上。Claire 等运用乳液聚合法，通过延迟环孢霉素 A(CyA)的加入时机避免环孢霉素的沉淀和聚集反应成功制备了共聚合两药的纳米复合物。
Na等人设计出的纳米级多聚体胶囊能够在根据不同的环境(比如酸性环境)中以不同的控制率释放药物从而使得肿瘤比正常组织更易吸收药物。目前的研究重点就是设计出新型多聚体，开发出特异性的药物－多聚体复合物精确控制药物释放。纳米技术中需要解决的问题就是生物利用度，因此，生物可降解多聚体胶囊显示出很好的应用前景。疏水性药物诸如紫杉醇、5－氟尿嘧啶能够和纳米级空泡(nanoscalecavities)以多聚体或脂质体的形式包裹从而促进药物吸收、增加药物生物利用度。纳米颗粒的靶向性是提高药物疗效、减少毒副作用的重要保证。针对不同的细胞，人们设计出不同的靶向纳米颗粒。例如：(1)上文中提到的"树枝状手臂"的纳米结构也可应用在肿瘤治疗的药物转运中，最近研究者在小鼠体内用这类特殊的聚合氨基胺树突状纳米结构携载抗肿瘤药靶向杀伤上皮肿瘤；(2)网状内皮系统中的巨噬细胞虽能通过胞吞作用清除大多数病原微生物，但也有一些微生物不能被杀伤，比如分枝杆菌、利什曼原虫等，将抗微生物药物与纳米颗粒包被可以天然的靶向作用于感染的巨噬细胞通过胞吞作用进入细胞内部有效地杀伤病原微生物；(3)淋巴细胞表面表达CD3抗原，研究者在实验中用抗CD3的生物素化抗体与纳米颗粒的共轭复合物证实了这种方法能通过胞吞作用明显增加药物摄入，且具有良好的人为靶向性；(4)内皮细胞在肿瘤、炎症、应激、血栓形成的等病理过程中起重要作用，早期有人设计出聚苯乙烯纳米颗粒能增加骨髓窦内皮细胞对这种纳米颗粒的捕获，这种捕获不同于之前提到的胞吞方式，而是受体介导的内在化模式，与内皮细胞的形态无关，而是与内皮细胞表面特殊位点有关，反映了血管特异性受体的表达，故可以在纳米颗粒表面覆盖一层合成聚合物和适当的配体，利用受体－配体特异性结合方式，载药的纳米颗粒能够对特异性细胞有靶向作用，并能在体内定位。如果在体外增加一种快速震荡磁场或热源，则能激活某些携载化疗药的纳米颗粒，控制这种颗粒的完整性、给药率，好定位药物释放，并能在器官、组织、细胞各水平上克服耐药性，直接作用于肿瘤细胞，减少全身毒副作用。有学者近年还报道了用脂质体多聚阳离子质粒DNA 纳米颗粒携载多肽抗原免疫小鼠从而建立了新型肿瘤疫苗转运系统的模型，产生的疫苗较传统似乎更加有效，开辟了靶向应用纳米药物的新思路、新方法。
二、载药纳米技术与多药耐药逆转
(一) 肿瘤的多药耐药
多药耐药形成机制相当复杂，而且是多因素的。与细胞膜有关的因素有：P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白(LRP)、乳腺癌抗药性蛋白(BCRP)的高表达；与细胞质/细胞核有关的因素有：谷胱甘肽 S 转移酶(GST)和谷胱甘肽(GSH)的升高、拓扑异构酶(TOPO)活力降低、凋亡抑制以及肿瘤细胞某些生化特征的改变：如膜离子通道、蛋白激酶 C(PKC)、磷酸化水平变化等。这些耐药机制可能单独或联合在多药耐药的形成中起作用。
(二) 多药耐药逆转剂研究现状
逆转MDR，使化疗失败的机率下降，具有很高的临床价值， MDR逆转已成为目前国内外化疗药物研究的重要方向之一。人们对逆转MDR进行了大量的研究工作。目前除了第一代和第二代P-gp抑制剂，其他的耐药逆转剂均未进入临床，但第一代P-gp抑制剂疗效差，而第二代P-gp抑制剂毒副作用较大，其中临床试验研究较多的是维拉帕米(VRP)和环孢霉素A(CyA)，但其毒性问题成为其由试验到临床使用的主要障碍。一方面所用逆转剂本身有毒性，如经典的逆转剂逆转MDR是剂量依赖性的，大剂量VRP会产生严重的心脏毒性及其他不良反应；临床已应用的CSA有肾、肝、神经毒性等。另一方面逆转剂缺乏肿瘤细胞识别特异性，会导致化疗药物药动学发生改变，增加毒性，如药物清除率下降、半衰期延长、血液浓度增高、分配体积增加等，都会增加对正常组织的毒性。且相对于耐药机制的复杂性与多重性，这类药物的逆转机制单一性亦是临床使用效果欠佳的重要因素。所以迄今为止人们还没有找到在临床上行之有效的克服耐药的方法。
(三) 载药纳米复合物逆转多药耐药
寻找低毒高效的MDR逆转剂是目前研发相关药物的主要方向。多药耐药机制的复杂性决定了在逆转MDR中应有协同用药的思路。既往的协同用药仅指多种药物的应用，而今"协同"的外延已扩展到协同药物剂型的改变。目前认为：任何能提高肿瘤细胞内化疗药物有效浓度的方法都是克服多药耐药的可行方法。纳米技术通过有效的改善化疗药物给药途径，拮抗和抵消肿瘤细胞主动外排药物的作用从而提高了肿瘤细胞内的药物浓度。
有不少文献报道通过制作不同的药物纳米颗粒来逆转MDR。DeVerdiere等研制聚氰基丙烯酸异已酯和聚氰基丙烯酸异丁酯两组纳米粒，观察它们对MDR的逆转情况，结果显示对P388细胞，游离的阿霉素和纳米粒载药的阿霉素，其在细胞内的浓度无差异，而对于耐药的P388/ADR细胞，聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒在细胞内累积的药物水平较游离阿霉素高15倍。Cuvier等用5种耐阿霉素的细胞株进行研究，结果显示，聚氰基丙烯酸异乙酯纳米粒组的ID50与游离组相比下降了30～250倍。纳米粒载药系统逆转肿瘤MDR的机理尚不十分明了，有学者认为聚氰基丙烯烷酯纳米粒阻止P-gp介导的跨膜转运，增大胞内的浓度，提高细胞毒性作用。Colinde Verdiere等认为柔红霉素聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒克服多药耐药是借助纳米粒与细胞的相互作用，增加细胞内的药物浓度，不是通过肿瘤细胞的内吞作用。Neamti等研究表明肿瘤耐药细胞对聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的内吞作用减弱，主要是其吸附在细胞的表面聚氰基丙烯烷酯纳米粒的缓释性，维持局部药物的高浓度，提高细胞毒作用。还有以脂质体或多聚体包裹的药物，通过胞吞作用进入细胞，改变药物的分布特性，选择性地作用于肿瘤细胞，减少相关毒性，通过增加药物在细胞内的浓度增加其逆转MDR的作用。
纳米材料携载化疗药改变了化疗药的剂型，克服了多药耐药，最近也有学者尝试将纳米材料共聚合化疗药和 MDR 逆转剂从而增强了多药耐药的作用。Claire 等运用乳液聚合法制备了共聚合两种药物(一种化疗药阿霉素和一种多药耐药逆转剂 CyA)的载药纳米复合物，并且证明因为 CyA 吸附在纳米材料的表面有快速释放相，在细胞局部浓聚，发挥 P-gp 拮抗剂作用，而阿霉素被包埋于纳米材料核心部位有快慢两个释放相，二者协同使得逆转多药耐药效应增强。我们的课题组进一步研究，水相吸附聚合法将功能化磁性纳米四氧化三铁颗粒共聚合阿霉素和汉防己甲素，增加了药物在多药耐药细胞 K562/A02 中的有效浓度增加化疗效果，载药纳米复合物有逆转多药耐药作用，而且在机制研究中发现，通过增加多药耐药细胞内的汉防己甲素浓度明显下调多药耐药基因 mdr1 mRNA 水平逆转多药耐药。
三、问题和展望
纳米技术改变了人们对世界的认识方式，在未来的医学实验、诊断和治疗中会使人们更加受益。载药纳米技术用于逆转肿瘤多药耐药是很有前途的应用之一，可为临床上对化疗产生耐药的患者提供一条新的治疗途径。由于多药耐药细胞存在多种耐药机制，不能形成细胞内有效药物浓度而载药纳米粒由于自身独特的尺寸效应和表面效应能够提高肿瘤组织药物浓度，达到多药耐药逆转作用。随着纳米技术研究的深入，有理由相信其会对肿瘤的治疗产生深远的影响。但纳米医学依赖于纳米技术材料和工具的合理设计，并须建立在对生物学过程充分认识的基础之上，才能有恰当的应用。目前其主要还是进行着临床前的研究，而大量随机的临床研究尚未见报告，因而其安全性和稳定性仍需进一步研究。
编辑: yang 作者:丁香园通讯员
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