宋启斌教授：生物标志与非小细胞肺癌的个体化诊断和治疗
1. EGFR突变与NSCLC治疗的高敏感性
EGFR激酶区域的突变仅限于某些亚型的NSCLC，如不吸烟的亚洲女性，组织类型为腺癌和支气管肺泡癌。有突变的患者对EGFR-TKI治疗反应更好。(图2)
大多数回顾性研究已经发现，EGFR突变的NSCLC中，50%~80%对Gefitinib、Erlotinib有反应，而且近来来自亚洲的报道更高，超过75%，而 Gefitinib、Erlotinib不敏感的患者中突变率为7%。提示突变是Gefitinib、Erlotinib敏感性增高的原因(具体见图2)。虽然大多数EGFR突变被认为是TKI戏剧性临床疗效的基础，但约10%~20%不存在EGFR突变的患者对Gefitinib有部分反应，提示EGFR突变对TKI疗效不是一个必不可少的决定因素。其他的分子异常，如EGFR基因扩增(基因拷贝数增加)与TKI的高敏感性相关，如Hirsh等报道，高EGFR拷贝数的患者有更好的预后。
进一步研究还发现，不同的突变与患者的临床治疗效果高低存在一定的联系，如外显子21点突变(L585R)与外显子19缺失性突变相比，后者可能对Gefitinib、Erlotinib有更好反应。
2. EGFR突变改变Gefitinib、Erlotinib敏感性的原因EGFR突变并没有影响与Gefitinib、Erlotinib结合的能力。其改变药物敏感性的原因可以通过癌基因依赖(oncogene addiction)模型来解释。
通过Ras-Raf-MEK-ERK1/ERK2，PI3K-Akt，STAT3/STAT5通路，EGFR突变高度激活EGFR调节的抗凋亡和增殖信号，导致癌症细胞变得依赖此信号以维持其生存——即细胞具有癌基因(突变的EGFR)依赖的特征；当使用特异性TKI阻断EGFR信号后，将消除其增殖性影响和输出生存信号，导致肿瘤细胞死亡。相反，正常细胞或非EGFR依赖的肿瘤细胞(对Gefitinib、Erlotinib无反应)不受影响，因为生存还受其他基因驱使，或者在EGFR抑制后能被其他的基因通路所弥补。
在癌基因依赖细胞，关键癌基因的急性失活(如TKI抑制EGFR)导致出现癌基因休克(oncogene shock)，即凋亡信号的输出大于生存信号，促使凋亡发生。癌基因休克可以解释：细胞毒化疗损伤细胞DNA，导致细胞周期停止——凋亡和生存信号的输出均减弱，结果细胞不再依赖某个癌基因，因此与TKI联合治疗时的疗效并不存在协同。
对于突变导致Gefitinib、Erlotinib敏感性增高，癌基因依赖也并不完全合理解释，因为EGFR单克隆抗体cetuximab虽然可以抑制EGFR导致凋亡和生存信号输出下降，但其疗效与突变无关。而且最近发现突变后的EGFR对Gefitinib亲合力明显提高；提示NSCLC细胞存在其他的因素参与疗效差异的形成。
3.EGFR突变与NSCLC治疗的耐药
EGFR突变并不都是导致Gefitinib、Erlotinib的敏感性提高，还是EGFR-TKI耐药的原因之一。
(1) 原发耐药
近来的研究提示，EGFR外显子20的插入性突变(D770_N771)可以使受体对EGFR-TKI的敏感性降低100倍，临床上也发现具有此突变的患者对EGFR-TKI治疗反应不明显。T790M突变很少见，大多数导致获得性耐药，但也与原发耐药相关；而且T790M突变与其他敏感性突变，如L585R同时存在时，癌症细胞对EGFR-TKI也是抵抗的。对于大多数对EGFR-TKI耐药的NSCLC而言，其肿瘤的形成很可能不是依赖EGFR导致。
KRAS是EGFR下游的关键调节分子，大约15%~30%的NSCLC存在KRAS密码子12和13突变，与患者的预后差相关。有研究提示KRAS突变可能是Gefitinib、Erlotinib原发耐药的原因。一般来讲，KRAS和EGFR突变NSCLC是相互排斥的，EGFR突变主要见于不吸烟者，而KRAS突变更常见于吸烟相关的癌症。因为KRAS突变总是发生于具有野生型EGFR的NSCLC中，所以难以区分对EGFR-TKI不敏感到底是因为KRAS突变，还是因为无EGFR突变。
其他EGFR下游分子也与Gefitinib、Erlotinib的耐药有关。如Akt的激活是药物不敏感的一个标志。Akt的激活由PTEN基因间接调节，NSCLC中，PTEN低表达(由于启动子甲基化)与Gefitinib、Erlotinib的耐药相关。IGFR1、ERBB3和ERBB2也参与Gefitinib的耐药。然而，近来大样本研究发现，PTEN和IGFR1的状态与Gefitinib的治疗反应不相关，提示上述分子在耐药中作用还待进一步研究。
(2) 获得性耐药
尽管在EGFR突变的NSCLC中，Gefitinib、Erlotinib可以达到戏剧性的效果，但开始治疗后6~12个月发生的耐药明显限制了患者生存时间的延长。对耐药分子和细胞机制深入了解是将来克服耐药的关键。在开始对Gefitinib、Erlotinib有反应但后来复发的患者(具有EGFR突变)中， 存在EGFR外显子20的继发性突变——T790M，耐药的原因是突变导致EGFR结构发生变化，使TKI与其结合出现位阻效应。在50%的TKI治疗后复发的NSCLC中可以发现T790M突变。一些研究者也认为，药物治疗之前T790M突变细胞即在患者体内存在，当细胞暴露于TKI后，由于耐药而导致发挥选择作用，使T790M突变细胞数目明显增多。因此也说明原发耐药和继发耐药的区别可能仅是T790M突变细胞的多少而已。
获得性耐药其他可能的机制包括，EGFR运输的改变，突变EGFR的扩增，或者EGFR的下游信号分子的高表达，或者细胞将药物的生物活性改变了。研究已经揭示，多药耐药蛋白ABCG2可以将Gefitinib泵出细胞外，因此导致耐药；但也有研究提示，Gefitinib本身可以使ABCG2和ABC转运P糖蛋白失活。
(二) ERCC1和RRM1与NSCLC的个体化治疗
10多年前即已知道，核酸外切修复参与几种癌症的耐药，如铂类药物。ERCC1是高度保守的蛋白，维持生命活动所必需。虽然它是几个核酸外切修复蛋白中的一个，但是具有限速酶的作用。2006年，Olaussen等报道，在手术后使用铂类药物为基础的辅助化疗NSCLC中，缺乏ERCC1蛋白的患者有更好的预后。ERCC1阴性的患者，接受辅助化疗者的中位生存期比接受单纯手术者增加了14个月(56个月对42个月，P=0.002)。而ERCC1阳性者是否接受辅助化疗与生存期无关(50个月对55个月，P=0.40)；在接受单纯手术的患者中，ERCC1阳性者生存期较ERCC1阴性者长。上述结果表明，ERCC1阴性的患者更能从含铂方案的辅助化疗中获益。在DNA合成和修复中的另一个关键酶是核甘酸还原酶M1(RRM1)，早期的研究已经发现，在肺癌中，RRM1的过表达与铂类药物和吉西他滨耐药有关，2006年，Ceppi等发现，ERCC1和RRM1的mRNA水平与患者的预后差明显相关，使用GP方案化疗。2007年2月，佛州坦伯Lee Moffitt癌症中心的研究指出，接受可能治癒性手术的早期(Ⅰ期)非小细胞肺癌(NSCLC)病患中，RRM1和ERCC1同时高表达的患者(大约30%，55/184)预后良好，因此显然与以前的报道相反。
但是，仔细分析RRM1和ERCC1的功能就可以合理解释，即RRM1和ERCC1在不同的阶段具有不同的角色。通过预防突变，RRM1和ERCC1可减少癌症的发生，或者阻止已经存在的肿瘤进展。因此对于未进行化疗的早期NSCLC患者，RRM1和ERCC1是预后好的标志。而对于晚期NSCLC，若进行化疗则可能导致耐药。因此，RRM1和ERCC1对于NSCLC患者治疗的选择存在2种情况：早期患者，RRM1和ERCC1高表达则可以不进行治疗；对于晚期患者，RRM1和ERCC1高表达，则不适合传统的化疗，可使用EGFR抑制剂。
Reiman等采用免疫组化技术检测JBR10研究中265例NSCLCβ微管蛋白III的表达，发现在辅助化疗组，β微管蛋白III高表达者有更长的无复发生存期(P=0.002)，提示长春瑞滨+顺铂方案辅助化疗可能使高表达β微管蛋白III的NSCLC患者获益更多。
(三)EMP-1与NSCLC的个体化治疗
Anjali等分析39例使用Gefitinib单药治疗的晚期NSCLC患者，发现低EMP-1表达的患者反应的可能性高(70%)，若EMP-1表达增加，则反应的可能性很低(5%)。临床对Gefitinib存在反应的患者基本不会表达EMP-1，而14个表达EMP-1的患者中，除一个病情稳定外，均出现疾病进展。
分析103例非选择的肺癌患者的标本，发现鳞癌的EMP-1表达率为66%，腺癌为40.9%。分析EMP-1表达与EGFR突变之间的关系发现，表达EMP-1的患者不存在EGFR突变。
分析Gefitinib获得耐药的患者发现，这些患者为在诊断时为BCA，开始对Gefitinib存在反应，由于存在L858R突变，Gefitinib治疗前的标本EMP-1表达很低(小于10%)，这些患者治疗160天后出现耐药，分析标本发现，患者出现了新的T790M突变，同时，EMP-1表达的表达也明显上升。提示EMP-1是Gefitinib原发和获得耐药的生物标志，而与EGFR的激酶区域突变无关。不是所有的对Gefitinib无反应的患者存在EMP-1表达，提示Gefitinib的耐药存在其他机制。
(四) EGFR突变与NSCLC的放疗敏感性
除了众所周知的SCLC和NSCLC之间存在明显的放疗敏感性差异之外，在NSCLC中相同的组织类型之间也存在明显的差异。肿瘤放疗个体化的关键是能预测肿瘤内在放射敏感性。
在多种肿瘤(包括NSCLC)中，EGFR的激活和表达是放疗敏感性的决定因素，相反，突变功能的丢失或使用抗EGFR治疗可以增加放疗的敏感性。Amit等使用19个NSCLC细胞系，10个具有无突变的EGFR，6个为ΔE746-ΔE750缺失，3个为L858R替代。发现突变的细胞系对放射线更敏感，原因是细胞对出现的DNA双链断裂的修复延迟，凋亡增加。而且，存在对Gefitinib耐药T790M的NSCLC细胞系H1975同样对放射线敏感。
七、 NSCLC的新生物标志——癌症干细胞
癌症干细胞比分化的肿瘤细胞对化疗更具抵抗性。癌症干细胞与已分化的其他肿瘤细胞可能存在基因表达谱的差异，如果能发现这些差异，不仅作为新的生物标志物用于预测肿瘤的疗效，还可作为治疗靶点。
体外研究已经发现，仅仅1/1000-5000 的肺癌细胞能形成新的克隆，提示不是每个肺癌细胞具有肿瘤起源的功能。Kim等发现，当小鼠暴露到肺损伤药物萘中后，少数表达了Clara 和肺泡特异标志的细胞对萘明显抵抗而且继续分裂增殖。这种细胞可以被Sca-1pos CD45neg Pecamneg CD34pos所识别，在体外具有自我更新和分化的能力，可以分化为Clara 细胞和肺泡细胞，因此被称为细支气管肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cell，BASC)。
LSL-K-rasG12D小鼠带有癌基因K-ras，但K-ras处于失活状态。当转导腺病毒AdCre后会导致K-ras表达，出现不典型腺瘤样增生(Ⅱ型肺泡细胞)，甚至腺瘤和腺癌。在Kim等的研究中，随着肿瘤的发生和进展，BASC的数目明显增加。提示通过持续的K-ras活化，双标记阳性的BASC为肺腺癌的起源细胞，也就是说，肺癌干细胞可能起源于BASC。
研究发现，成人干细胞能通过侧群(side population，SP)表现型识别——高染料Hoechst 33342排出能力。2007年，Hung等使用流式细胞术从六个人肺癌细胞株中分离出SP细胞。移植免疫缺陷小鼠实验显示：与非SP细胞相比，SP细胞具有高肿瘤起源的能力和侵袭能力。SP细胞具有ABCG2、ATP结合转运载体的高表达，对多种化疗药物耐药；而端粒酶逆转录表达更高，提示具有无限增殖潜能。微小染色体维持蛋白7(MCM7)的mRNA水平在SP细胞中降低，提示大多数细胞处于G0静止状态。对16例临床肺癌样本分析同样发现存在的SP细胞。因此，肺癌中的SP细胞是肺癌起源细胞干细胞，其基因表达标志可能不仅是治疗的有效靶点，也是药物开发的依据。
参考文献(略)
编辑: blue 作者:丁香园通讯员
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