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miRNA研究解决方案
美国GeneCopoeia公司是目前全球最大的基因和miRNA功能研究材料供应商之一，为客户提供全球最多的人类编码全长蛋白的ORF克隆。这些ORF构建在具有不同特征的多套载体中，使这些克隆易于在多种不同类型的细胞及无细胞转录翻译偶联体系中进行功能分析、蛋白质表达和纯化、大规模功能基因组学和蛋白质组学研究。 GeneCopoeia关注miRNA研究领域多年，基于自身强大的专业技术与完善的基因功能研究 。
miRNA表达量差异分析
miRNA功能获得
miRNA功能缺失
miRNA功能回复与确证
小RNA的合成
2. miRNA的生物合成
和siRNA一样，miRNA也是由21~25 nt组成的小RNA分子。不过，它们两者的生物合成过程却有着显著的差别。miRNA分子的初级前体（pri-miRNA）就是由细胞基因组编码产生的，而编码pri-miRNA的这段基因在基因组中所处的区域主要由RNA聚合酶II负责转录。pri-miRNA分子含有茎环结构，miRNA分子就存在于该结构的5'端或3'端之中。
Drosha与其它分子一起形成“微处理器复合体（microprocessor complex）”，从而发挥分子尺的作用，判断pri-miRNA中的切割位点。在这个复合体中，Drosha与其辅酶因子DGCR8或Pasha（选择哪一个主要取决于物种）相互作用。与Drosha一样，DGCR8或Pasha同样能够在dsRNA结合结构域（dsRBD）的作用下与dsRNA相结合。一个典型的多细胞动物的pri-miRNA包含一个33bp长的茎环结构、一个末端环状结构，以及一个ssRNA侧翼片段（flanking segment）。这个侧翼片段对于pri-miRNA与DGCR8因子的结合非常重要，而33bp长的茎环结构对于它们的有效结合同样意义重大。Drosha蛋白可以利用微处理器复合体这种“切割前”复合体短暂地与dsRNA的茎环结构相互作用，而蛋白的酶切作用中心位点位于ssRNA与dsRNA交界处长11bp的一段序列中，在该位点切开之后会形成交错配对的切口，生成长约65~70bp的pre-miRNA。这种情况下，DGCR8蛋白可以发挥分子尺的作用，“测量”ssRNA与dsRNA交界处的长短。微处理器复合体很有可能通过识别ssRNA末端的环状结构找到RNA，然后在另一端与其茎环结构相结合。在这种情况下，可能会在一段靠近RNA末端环状结构的长约11bp的可变区域里发生不完全剪切。不过，绝大部分的pri-miRNA分子内部都含有突出结构，或者配对不十分匹配的区域，而这段区域也都是位于离末端环状结构大约11bp处，因此这就能够避免在该处发生错误切割的问题。
最近发现，有很多编码这种miRNA的基因都位于内含子区域，对这类miRNA的处理是不需要Drosha酶参与的，而是直接通过剪接体（spliceosome）来完成。这些内含子miRNA（也被称作mirtron）3'端的茎环结构和一个细小的、已注释的内含子3'端的剪接位点的剪切机制与核内pre-mRNA的剪接机制相同，所以无需Drosha酶的参与。接下来，以套索形式被剪接体释放出来的mirtron前体分子会在去分支酶（de-branching enzyme）的作用下线性化。随后，它们模拟pre-miRNA的发夹结构直接进入miRNA处理程序，继而被转移至胞质被Dicer酶处理，而不是被Drosha酶剪切。
由于Dicer酶和Drosha酶缺乏剪切精确性，因此可能会生成一系列5'端和3'端各异的miRNA-miRNA*双链产物。在动物细胞中，大部分miRNA都会与目的mRNA形成配对不十分精确的杂交双链。这种配对的精确性绝大部分都是由miRNA分子的5'端的第2~8位序列来提供的，这段序列也被称作种子区域。Dicer酶和Drosha酶不精确的剪切既有可能改变种子区域，也有可能颠覆双链分子5'端和3'端的相对稳定性。不过，最近一系列针对小RNA开展的深度测序研究结果显示，人体细胞可能刚好利用了这种剪切的不精确性，因为这样可以利用同一前体RNA分子获得大量不同的miRNA产物，从而大大扩展了miRNA分子的调控对象和途径。
3. 不依赖于RNaseIII的小RNA合成途径
在某些情况下，小RNA似乎并不来源于dsRNA，但此时小RNA的沉默信号同样获得扩增。因为这些小RNA不源自dsRNA前体，因此RNaseIII不参与它们的合成过程。这种情况的出现让我们开始质疑RNAi的定义。接下来，我们将详细介绍这种不依赖于RNaseIII的小RNA合成途径，包括piRNA、21U-RNA以及秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）体内次级siRNA（secondary siRNA）的合成途径。
piRNA因其可与名为PIWI蛋白的Argonaute家族蛋白相结合而得名。我们以前就已经知道，Argonaute家族蛋白位于RISC中心，它们可以直接与小RNA的向导链相结合。Argonaute蛋白由一个可变的氨基末端和PAZ、MID及PIWI这三个保守结构域组成。小RNA的3'端可以与Argonaute蛋白的PAZ结构域相互作用，而小RNA分子5'端的磷酸基团则可以与Argonaute蛋白MID结构域和PIWI结构域之间的裂隙相结合。PIWI结构域具有RNaseH样的折叠结构和切割活性（尽管某些Argonaute蛋白看起来没有剪切活性）。
其中，PIWI家族蛋白可以与piRNA分子相结合（表1）。piRNA分子只见于生殖细胞当中，它们对于生殖细胞的发育作用非常重要，它们可以在哺乳动物、鱼类和黑腹果蝇（D. melanogaster）生殖细胞里抑制细胞中转座子的表达。piRNA要比miRNA稍长，约24~31 nt。通常，在piRNA分子的5'端会有一个单磷酸基团和一个尿嘧啶。piRNA与哺乳动物细胞的miRNA不太相似，倒是与植物细胞的miRNA比较相似。piRNA 3'端核苷酸有2?-O-甲基化（2?-O-Me）修饰现象，这通常都是HEN1样甲基转移酶（HEN1-like methyltransferase）催化的结果。有研究发现，Dicer蛋白发生突变并不会影响piRNA的生成，这说明piRNA的合成途径与miRNA和siRNA完全不同，并且该合成途径没有dsRNA前体分子的参与。
对与黑腹果蝇（D. melanogaster）PIWI亚科蛋白PIWI、AUB和AGO3相互作用的小RNA进行测序后发现，piRNA主要在逆转录转座子（retrotransposon）的反义链的帮助下才得以与AUB蛋白和PIWI蛋白结合；而它与AGO-3的结合则主要获得了逆转录转座子的正义链的帮助。与AUB和PIWI相结合的piRNA在5'端几乎都会有尿嘧啶，而与AGO-3相结合的piRNA分子则倾向于在第10位碱基处出现腺苷酸。与AUB结合的piRNA的前10个核苷酸能够与和AGO-3相结合的piRNA分子的前10个核苷酸互补。另外，由于PIWI亚科蛋白具有酶切活性，因此它们可以在与之结合的piRNA底物的对应链上的第10个碱基处进行切割。这种现象提示piRNA分子生成途径可能是一个自我不断扩增的循环反应（见图1）。
在这个循环反应中，结合了正链piRNA分子的AGO3蛋白会切割长链的反义转录产物，促使反义piRNA分子的5'端与AUB蛋白或PIWI蛋白相结合，然后结合了反义链piRNA分子的AUB蛋白或PIWI蛋白又会切割长链的正义转录产物，促使正义链与AGO3蛋白相结合，如此循环、扩增下去。在这个被称为ping-pong循环扩增的途径中，转座子既是piRNA产物的来源，也是piRNA沉默的靶标。在piRNA 5'产物与下一个PIWI蛋白结合之后，会在另一个未知核酸酶的作用下生成piRNA 3'端，这步反应似乎发生在2?-O-甲基化修饰作用之前。这样最终得到的piRNA产物的大小就刚好符合通过印记实验（footprint）证明的能够与PIWI蛋白相结合的RNA分子的大小。在每一个PIWI亚科蛋白中，PAZ结构域都会远离MID结构域，它们之间的距离刚好符合与PIWI蛋白结合的RNA分子的长度。因此，PAZ结构域可能部分起到了一种分子尺的作用，帮助将piRNA分子处理成合适大小。这种扩增循环反应特点在斑马鱼（Danio rerio）生殖细胞和处于精子发生期中的、减数分裂粗线期之前的哺乳动物生殖细胞中也非常明显。
PIWI亚科蛋白可能会和与之相结合的piRNA一起，通过卵子进入胚胎当中，这说明piRNA分子可能会借此方式在种系中进行传播。但是其它证据表明，在胚胎当中必须有不同于ping-pong循环的其它方式来扩增piRNA。首先，黑腹果蝇（D. melanogaster）细胞中的扩增循环过程由AGO3蛋白和AUB蛋白的参与而启动，但是piRNA却仍然结合在PIWI蛋白上。从亚细胞定位及细胞类型就可以区分PIWI蛋白与AGO3蛋白和AUB蛋白；其次，piRNA源自基因组中的flamenco位点，该位点只与PIWI位点相关。这些证据都表明由flamenco位点编码的piRNA是以一种不同于ping-pong循环的其它方式合成的。不过，是否真的存在这样一条途径还需要进一步研究。
在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中还发现了一种新的小RNA，名为21U-RNA。这种小RNA仅长21 nt，在5'端的第一个碱基都是尿嘧啶，但是后面的20个碱基里就不会再出现尿嘧啶了。编码21U-RNA的遗传区域中在21U-RNA起始碱基上游会有一个特征性的42bp长的序列。很有可能这些RNA源自数千个独立的、自主表达的基因位点，这些基因位点广泛散布在一条染色体的两大块区域当中。这些位点在生殖细胞中各自单独表达，其产物与PIWI亚科成员PRG-1蛋白相结合。从这个角度来说，21U-RNA等同于秀丽隐杆线虫体内的piRNA。和piRNA一样，21U-RNA的合成依赖PRG-1蛋白的活性，而不是DCR-1（即秀丽隐杆线虫体内的Dicer）的活性。prg-1基因发生突变的秀丽隐杆线虫会表现出温度敏感不育表型而且后代数量会减少，这与PIWI蛋白参与生殖细胞维持作用有关。和其它处于减数分裂粗线期的哺乳动物生殖细胞中发现的piRNA一样，21U-RNA同样具有非常明显的序列多样性，但是它们缺乏明显的靶标。
在嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）这种纤毛虫动物中也发现了具有和piRNA类似作用的小RNA。这些名为scnRNA的小RNA分子可以诱导转座子样DNA序列降解，也能与PIWI家族蛋白TWI1相结合。与piRNA及21U-RNA不同的是，scnRNA是由Dicer蛋白介导的途径合成的。
上面介绍的piRNA、21U-RNA和scnRNA这三种小RNA的合成都表明PIWI蛋白和piRNA机制是进化过程中获得的合成小RNA的途径，继而由小RNA利用各种不同策略沉默靶标。
RNA沉默机制包括下调内源性基因表达、限制自私基因和外源性遗传物质的表达等，不论哪条途径都需要多种因子，比如Dicer酶的参与。因此，在不同沉默途径之间就会出现竞争情况。当然细胞也有会办法来应对这种竞争现象，比如扩增较弱的那个沉默信号等等。在秀丽隐杆线虫中，会有各种不同的Argonaute蛋白分别负责在RNAi途径的不同阶段依序发挥作用，如在RNA沉默的第二阶段指挥不依赖RNaseIII的小RNA分子的合成。首先，“初级”Argonaute蛋白，例如用于合成外源性siRNA（exo-siRNA）的RDE-1蛋白和用于合成内源性siRNA（endo-siRNA）的ERGO-1蛋白会被“初级”siRNA（即长链dsRNA经DCR-1蛋白处理得到的第一轮siRNA产物）引导；随后，这种沉默信号会被扩增，产生大量“二级”siRNA信号，这轮反应主要是依靠RdRP蛋白（见图1）。这些二级产物会分别与不同的“二级”Argonaute蛋白，比如WAGO亚科蛋白SAGO等蛋白相结合，来介导下游沉默作用。
在植物细胞中，RNA还具有异常特征，比如缺乏多聚A尾，缺乏5'帽结构等，这些小RNA会在RdRP酶的作用下形成dsRNA，继而成为Dicer酶的底物，然后被切割成双链siRNA。相反，在秀丽隐杆线虫体内的RdRP大部分的产物都是21 nt的单链小RNA分子，它们的5'端会有三磷酸基团，而且这种小RNA是RdRP酶直接以目的mRNA为模板，以一种不需要引物的方式合成的，而不是常规的通过Dicer酶切割dsRNA而来。这种合成方式使得dsRNA的合成不再需要消耗siRNA，不过我们还不清楚这些二级siRNA分子的3'端是如何产生的，也不清楚是哪种“分子尺”决定siRNA分子的大小。
编辑: helen
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