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miRNA研究解决方案
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miRNA表达量差异分析
miRNA功能获得
miRNA功能缺失
miRNA功能回复与确证
RISC复合体与小RNA分子结合及对其分选
在由dsRNA前体分子启动的基因沉默途径当中，先由Dicer酶剪切得到小dsRNA中间分子即小RNA双链，然后这些小RNA双链必须先解链，形成“有功能的”单链，这样才能为RISC复合体起到“向导”作用。对于每一个小dsRNA分子来说，只有一条链，即向导链才能与特定的Argonaute蛋白结合，形成活化的RISC复合体。而另一条链，即随从链则会被降解。很多真核生物不止表达一种Argonaute蛋白，这些蛋白都能够与小RNA分子结合，不论这些小RNA分子的序列如何。那么这些小RNA分子是如何被Argonaute蛋白识别、分选，并与之结合的呢？
1. 结合、装载过程
由dsRNA前体分子生成的小RNA在结合、装载到RISC复合体时会从双链状态解离成单链状态。这其中的关键步骤就是小dsRNA的解链过程和向导链被选择的过程。大家普遍认为RISC装载过程实际上就是一个热力学问题。由于小dsRNA分子的热力学不对称（thermodynamic asymmetry）特性使得其中一条链被选择，另一条链被“抛弃”、降解。也就是说，小dsRNA分子中哪一条链的5'端如果在热力学上显得更不稳定，那么它就更有可能被RISC复合体“挑中”成为向导链，这也就是所谓的不对称原理（asymmetry rule）。
在siRNA途径中，我们都知道Dicer蛋白和Argonaute蛋白之间能够发生相互作用，这说明siRNA分子的生成和它与RISC复合体的结合过程可能是藕联的。比如，在黑腹果蝇细胞中，DCR-2蛋白不仅将siRNA转移给RISC复合体，还能和siRNA分子一起参与形成RISC复合体。这就说明DCR-2蛋白不仅仅只在siRNA沉默途径的第一阶段发挥作用。siRNA双链与AGO2蛋白的结合也是在有DCR-2蛋白和R2D2蛋白的RISC复合体的帮助下完成的。siRNA双链中究竟哪一条链能够与AGO2蛋白结合似乎取决于DCR-2-R2D2异源二聚体与siRNA双链分子之间的方向。可能是先由R2D2蛋白来探测siRNA双链的热力学稳定性，然后与其中更为稳定的那条链相结合，然后DCR-2蛋白负责招募较不稳定的那条链。DCR-2-R2D2异源二聚体可能还会通过DCR-2蛋白与AGO2蛋白间的相互作用来招募AGO2蛋白。以前的模型认为从双链到单链的沉默诱发转换过程可能是在某种未知的ATP依赖的RNA解旋酶的作用下完成的。不过，如图1所示，siRNA双链的解旋过程和向导链与RISC的结合过程都是在AGO2蛋白降解随从链过程的推动下完成的，而这个过程是不需要消耗ATP的。从中间切割随从链会降低退火温度和双链结合的自由能，这样就会促进siRNA双链的解离。这些研究发现都表明，siRNA分子是先以双链状态与含有AGO2蛋白的pre-RISC结合的。
各种Argonaute蛋白分选小RNA机制简介。
小RNA可以根据各种不同类型的Argonaute蛋白来进行分类，这其中也牵涉好几种机制。a，在黑腹果蝇体内，由dsRNA分子生成的小RNA分子会根据其自身的结构与AGO1或AGO2蛋白结合。如果小dsRNA分子中出现错配或者像miRNA那样在中部出现片段膨出现象，那么它们就会与AGO2蛋白相结合。之所以会出现这种选择机制是因为与小RNA分子相结合的Argonaute蛋白是组成含有Dicer蛋白复合体的一部分，而Dicer蛋白有两种形式，即DCR-1和DCR-2，它们分别能够与不同结构的RNA分子相结合。DCR-2蛋白会与R2D2蛋白一起形成异源二聚体，这种二聚体能够与配对非常良好的RNA双链相结合，但对中部有错配的dsRNA识别能力则会大打折扣。另一种复合体DCR-1-LOQS则主要识别含有错配片段的双链RNA分子。AGO2蛋白能高选择性地与DCR-2-R2D2复合体相结合。小dsRNA分子会进一步被处理形成小ssRNA分子（图1）。b，拟南芥的miRNA和反式作用siRNA（ta-siRNA）的5'端都含有尿嘧啶，因此与AGO1蛋白的亲和力比较高。而AGO2蛋白和AGO5蛋白则分别比较容易与5'端含有腺嘌呤和胞嘧啶的RNA分子结合。不过，这种依靠RNA分子5'端碱基的分选方式应该不是拟南芥唯一的选择机制。c，在秀丽隐杆线虫和酿酒酵母等物种体内，次级endo-siRNA都具有非常显著的链选择性，只有反义siRNA链能够结合到Argonaute蛋白上。这些siRNA都是RdRP蛋白合成的。在秀丽隐杆线虫体内，RdRP蛋白可以直接以目的mRNA为模板，以不依赖引物的方式合成小RNA。因此，这些次级小RNA分子都表现出一种负极性（negative polarity），这种机制进一步巩固了初级小RNA分子的沉默效果。
相反，在人体细胞中，pre-miRNA会与AGO2蛋白、DICER1蛋白和TRBP蛋白组成的三聚体相结合。这个复合体可以利用pre-miRNA降解目的RNA，也能在缺乏ATP水解作用的情况下区分miRNA和miRNA*，这说明在这个三聚体当中，是DICER1蛋白来切割并感知RNA分子的热力学稳定性情况的。
这个RISC复合体聚合的过程也能以一种不依赖酶切作用的途径来完成。在人体细胞内，四种Argonaute蛋白中有三种，即AGO1、AGO3和AGO4都缺乏酶切活性，但是它们仍然能够与siRNA向导链结合。同样，尽管我们最开始认为的在未解链pre-miRNA双链分子中，由于存在错配情况，会遮蔽随从链的酶切位点，但是我们仍然在人体细胞内发现单链miRNA能够与AGO2蛋白相结合。因此，在人体细胞内肯定还存在一条不依赖酶切作用的旁路途径来帮助RISC复合体的组成。在这条旁路途径中，我们已经发现RNA解旋酶A可能会参与其中，发挥RNA解链作用。
2. 小RNA的分选过程
RISC复合体一旦组成，就会继续完成RNA沉默机制里后续的一系列反应，包括抑制mRNA翻译，维持基因组稳定性等等。RISC复合体的这些特异性功能都与和Argonaute蛋白相结合的特殊蛋白有关。换句话来说，那就是不同的RISC复合体可根据组成它的Argonaute蛋白来区分。因此，哪一种小RNA与哪一种Argonaute蛋白相结合就显得尤其重要了。我们对各种小RNA与Argonaute蛋白相结合的情况，即小RNA的分选机制进行了研究，发现这里面存在好几个影响因素，比如小dsRNA的结构、小RNA 5'端的确认、组成小RNA分子的碱基是否存在修饰情况及存在何种修饰情况等等。
在黑腹果蝇中，pre-miRNA是由DCR-1蛋白生成的，而exo-siRNA双链则由DCR-2切割长dsRNA分子而来（图2a）。小RNA生成之后就依其自身结构与AGO1或AGO2蛋白相结合。如果小dsRNA分子中有不配对序列存在，中部形成突出结构（该情况多见于miRNA前体分子中），那么它就会与AGO1蛋白结合。如果小dsRNA之间配对情况良好，那么它就会与AGO2蛋白相结合。这是因为DCR-2-R2D2异源二聚体可以招募AGO2蛋白形成RISC复合体前体，这种复合体可以很好地结合配对良好的小dsRNA分子，但是不能与上述配对不佳的小dsRNA分子结合。这样，DCR-2-R2D2二聚体就不仅能够根据小RNA分子的热稳定性情况来决定siRNA装载的极性，还可以在AGO2蛋白装载到RISC复合体过程中担负起一个“守门员”的角色，从而促进siRNA而不是miRNA与RISC复合体的结合。这些现象说明，每一个siRNA双链分子在生成之后都会从Dicer蛋白的活性位点上解离，然后与DCR-2-R2D2二聚体相结合。
不过，虽然AGO1蛋白比较倾向于结合序列中部有错配情况的小RNA分子，但是有大部分没有错配情况的miRNA-miRNA*双链分子同样能够与含有AGO1蛋白的RISC复合体结合，这说明AGO1结合途径是有选择性的，它不会毫无保留地完全接受被AGO2蛋白“筛掉”的小RNA分子。
小RNA分子5'端是由哪种碱基组成的，这些碱基的磷酸化情况如何等等这些信息也能够影响Argonaute蛋白与小RNA分子结合的情况。在拟南芥中，因为所有的miRNA都只由一种特定的Dicer酶--DCL1蛋白生成，然后再由不同的Argonaute蛋白对这些小RNA分子进行分选、结合，因此这些小RNA经由Dicer蛋白处理的过程和它们与Argonaute蛋白结合的过程不是藕联的，这一点与黑腹果蝇体内的情况完全不同。在拟南芥中，miRNA和反式作用siRNA（ta-siRNA）这种负责调控植物发育的小RNA分子的5'端通常都是由尿嘧啶组成的，因此倾向于与AGO1蛋白结合（图2b）。相反，AGO2蛋白则倾向于与5'端是由腺嘌呤碱基形成的小RNA分子结合。而AGO5蛋白则倾向于与5'端是由胞嘧啶碱基形成的小RNA分子结合。
有意思的是，如果miRNA双链中一条链的5'端是腺嘌呤碱基，另一条链的5'端是胞嘧啶碱基，那么它们会分别与AGO2蛋白和AGO5蛋白结合。于是我们提出了一个假设，即Argonaute蛋白与小RNA分子之间的结合亲和力是由小RNA分子5'端的碱基决定的。虽然在植物细胞中这条规律似乎屡试不爽，但是仍然有例外情况出现：拟南芥中有一种miRNA叫做miR-172，它的5'端是由腺嘌呤组成的，但是它却倾向于与AGO1蛋白相结合。另一种5'端是由腺嘌呤组成的miRNA，叫做miR-390，它则倾向于与AGO7蛋白相结合。因此，这种5'端决定机制似乎不是唯一的一种决定机制。
秀丽隐杆线虫似乎采用另有一种机制来生成次级siRNA。通过这条机制产生的小RNA分子能特异性地与SAGO蛋白结合。这些次级siRNA分子的5'端携带一个由三磷酸基团修饰的碱基，这是RdRP反应特有的产物，这些次级siRNA分子可能就是通过这个独特的标志来与SAGO蛋白相结合，而不是与RDE-1蛋白等初级Argonaute蛋白结合的。
在粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和秀丽隐杆线虫体内的Endo-siRNA（包括前面刚刚提到的次级siRNA）双链分子都具有非常明显的单链偏好性（strand bias），即在这些小RNA双链分子中，只有RdRP酶根据目的RNA链为模板合成的反义siRNA单链才能结合到含有Argonaute蛋白的复合体上。这是因为如同图2c中所示的那样，秀丽隐杆线虫体内的RdRP酶可以以一种不需要引物的方式根据目的RNA链为模板合成小RNA分子。这样生成的所有的次级siRNA分子都具有负极性（negative polarity），可以进一步加强对目的mRNA分子的沉默作用。粟酒裂殖酵母同样存在这种单链偏好性的原因可能是由于它体内存在另一种不同于秀丽隐杆线虫体内的RdRP机制。在粟酒裂殖酵母中，Dicer蛋白会与一个含有RdRP酶的名为RDRC的复合体以及另一个含有Argonaute蛋白的名为RNA诱导的转录沉默复合体（RNA-induced transcriptional silencing complex,RITS）的复合物相结合，从而在Dicer蛋白切割RdRP酶产物的同时促进siRNA分子定向与Argonaute蛋白相结合，并剪切由RdRP生成的dsRNA产物，通过这种方式形成反义链偏好性。这说明，Dicer蛋白的酶切极性决定了siRNA单链分子在与Argonaute蛋白相结合时表现出来的极性。
Argonaute蛋白随着进化的历程表现出了明显的多样性，形成了各种功能。根据我们前面所述的Argonaute蛋白对小RNA分子分选功能的描述我们可以推测，Argonaute蛋白功能方面的多样性可能是它们与不同小RNA分子相结合之后产生的结果。我们可能可以根据Argonaute蛋白的构象来判断它们会与哪种小RNA分子结合，但首先，我们还得弄清楚真核生物Argonaute蛋白的构象。
编辑: helen
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