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miRNA研究解决方案
美国GeneCopoeia公司是目前全球最大的基因和miRNA功能研究材料供应商之一，为客户提供全球最多的人类编码全长蛋白的ORF克隆。这些ORF构建在具有不同特征的多套载体中，使这些克隆易于在多种不同类型的细胞及无细胞转录翻译偶联体系中进行功能分析、蛋白质表达和纯化、大规模功能基因组学和蛋白质组学研究。 GeneCopoeia关注miRNA研究领域多年，基于自身强大的专业技术与完善的基因功能研究 。
miRNA表达量差异分析
miRNA功能获得
miRNA功能缺失
miRNA功能回复与确证
内源性基因沉默途径
RNAi途径的各种效应分子长约20~30 nt。这些小RNA分子会与RNA诱导的沉默复合体（RISC）中的组成蛋白结合形成复合物。在植物和动物（单细胞生物除外）中，这种复合物的催化核心是AGO2蛋白（属于高度保守的Argonaute蛋白家族成员）。各种效应分子沉默基因表达的机制（图1）。
在稷酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、植物和哺乳动物细胞里都发现了TGS途径。在稷酒裂殖酵母中，该基因沉默功能具体是由RNA介导的转录沉默复合体（RNA-induced transcriptional silencing complex, RITS）来完成的。RITS复合体包含Ago1蛋白、染色质域蛋白（chromodomain protein，指从酵母到哺乳动物的真核生物中普遍存在的大约由50个氨基酸组成的一个保守结构，它可介导蛋白间相互作用，也可与DNA和RNA相结合）——Chp1蛋白，以及包含甘氨酸、色氨酸重复序列的Tas3蛋白。在哺乳动物细胞内，具体是哪种机制在发挥作用还不清楚，但是可以肯定的是AGO1蛋白和AGO2蛋白肯定都发挥了重要的作用。最近，有研究发现在体外培养的人体细胞中，miR-320这种miRNA分子可以调控RNA聚合酶III的亚单位POLR3D蛋白的转录。
目前，人们已经在包括人、小鼠、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、秀丽隐杆线虫等多个物种体内发现了各种内源性的小RNA。这些小RNA分子当中有一些源自转座子、病毒以及DNA重复序列。这些小RNA分子都有一个共同的特点，那就是它们都能够与Argonaute家族中的PIWI蛋白发生相互作用，因此它们被称作PIWI相互作用RNA（PIWI-interacting RNA），简称piRNA。不过，piRNA分子只见于生殖细胞。最近，人们又在黑腹果蝇的生殖腺和体细胞组织以及小鼠卵母细中发现了一种新的内源性小RNA分子，称作endo-siRNA或esiRNA。在小鼠体内的endo-siRNA可能具有调控逆转录转座子移动（retrotransposon movement）的作用。在真菌、植物和动物细胞中已经发现了许多种小RNA分子，比如重复相关siRNA（repeat-associated siRNA, ra-siRNA）、小非编码RNA（tiny non-coding RNA, tncRNA）、反式作用siRNA（trans-acting siRNA, ta-siRNA）、扫描RNA（scan RNA, scnRNA）等（表1）。不过到目前为止，还没能够在哺乳动物细胞中发现上述小RNA分子中的任何一种。有证据显示，piRNA能够借助siRNA信号通路或miRNA信号通路等各种胞内途径来发挥作用，因此piRNA也是一个非常好的临床治疗候选靶点。
图1 细胞基因沉默机制示意图
a、在植物细胞和动物细胞中，初级miRNA（Primary microRNA, pri-miRNA）会由Drosha蛋白及其辅助因子DGCR8蛋白处理，形成前体miRNA（precursor miRNA, pre-miRNA），随后pre-miRNA被输出蛋白5（XPO5）转至胞质。胞质中的pre-miRNA与含有Dicer蛋白的RISC前体结合后被RISC前体处理生成向导链，随后向导链装载到含有基因沉默所有必需组分的holo-RISC复合体中。AGO2蛋白是RISC复合体中的催化核心。向导链能够与其靶mRNA分子3’ UTR结合。如果这种结合是完全互补的，如图中左侧所示，那么就会激活位点特异性切割途径，通过AGO2蛋白的催化作用降解mRNA靶分子。如果这种结合是不完全互补的，只是miRNA分子里的种子区（第2~8位碱基序列）参与了互补结合，如图中右侧所示，那么就会激活非序列特异性mRNA分子降解途径，通过P小体使mRNA分子降解。
b、与miRNA作用机制相仿，人工转录的shRNA（即图中质粒所编码的）也可以被XPO5蛋白转运至胞质。胞质中的dsRNA被Dicer蛋白识别，并被降解成21~25bp的siRNA片段，然后装载到RISC复合体上。siRNA也能识别与其序列互补的细胞mRNA，然后通过AGO2蛋白使其降解。c，siRNA在核内如果能够与启动子区域互补，那么就能促使染色质重构和组蛋白修饰反应的发生，从而导致转录后基因沉默。在哺乳动物细胞中，这条途径的具体作用机制尚未完全阐明，但是Argonaute家族蛋白肯定在其中发挥了重要的作用。图中涉及的蛋白包括TRBP（HIV tar-RNA-结合蛋白，也即TRBP2P）和PACT（蛋白激酶PKR激活剂，也即PRKRA）。m7G即7-甲基鸟苷。
*秀丽隐杆线虫piRNA是21nt。endo-siRNA(endogenous siRNA)：内源性siRNA；miRNA(microRNA)：微小RNA；natRNA（natural antisense transcript siRNA）：天然翻译转录siRNA； piRNA（PIWI-interacting RNA）：PIWI相互作用RNA；ra-siRNA（repeat-associated siRNA）：重复关联siRNA；scnRNA（scan RNA）：扫描RNA；siRNA（short interfering RNA）：小干扰RNA；ta-siRNA（trans-acting siRNA）：反式作用siRNA；tncRNA（tiny non-coding RNA）：小非编码RNA。
编辑: helen
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