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miRNA研究解决方案

美国GeneCopoeia公司是目前全球最大的基因和miRNA功能研究材料供应商之一,为客户提供全球最多的人类编码全长蛋白的ORF克隆。这些ORF构建在具有不同特征的多套载体中,使这些克隆易于在多种不同类型的细胞及无细胞转录翻译偶联体系中进行功能分析、蛋白质表达和纯化、大规模功能基因组学和蛋白质组学研究。 GeneCopoeia关注miRNA研究领域多年,基于自身强大的专业技术与完善的基因功能研究 。

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小RNA分子的优化设计

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发布日期:2011-01-10 02:45 文章来源:美国GeneCopoeia(复能基因)
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关键词: GeneCopoeia RNAi   点击次数:

细胞基因可以被外源性的siRNA分子利用细胞内源性的PTGS机制特异性抑制。siRNA既可以用来转染细胞,随后直接进入RISC复合体;也可以借助含有Pol II启动子或Pol III启动子的载体在胞内表达、生成。这些RNAi“触发开关”可以在动物或植物细胞里经Drosha蛋白和(或)Dicer蛋白切割后以miRNA或shRNA的形式表达,不过不能在粟酒裂殖酵母细胞中表达。这些miRNA或shRNA随后会被Drosha和/或Dicer切割成为21~25 nt的小RNA。如果这些小RNA“触发开关”分子的两条链能够完全互补,那么随从链(passenger strand)就会被AGO2蛋白切割、降解,只留下向导单链作为模板帮助RISC复合体识别靶标基因,如图1所示。

大部分即将问世的以RNAi为基础的治疗方案都是采用直接将人工合成的siRNA分子转入细胞内的策略。使用这种人工合成分子的好处是可以利用各种化学修饰方法增强siRNA分子的稳定性,防止它们与其它非目的靶标发生错误结合,既能够避免特异性的脱靶现象(specific off-target effects)发生,同时又能够尽量减少对免疫系统的刺激,从而避免非特异性的脱靶现象(general off-target effect)发生。不过,这些外源性小RNA分子只能短暂地发挥作用,而借助在启动子控制下表达的shRNA或miRNA则可以达到长效抑制的作用。

传统意义上的siRNA是大约22nt长,在3'端有类似于Dicer蛋白的酶切产物的两个碱基突出的小RNA分子。由于并非所有siRNA都能够达到同样的基因沉默效果,所以在进行基因沉默治疗之前,我们需要进行大规模的筛查工作,找出沉默效果最佳的那个小RNA分子。鉴于此,人们制定了一整套siRNA设计规则。

此外,统计学分析也能帮上忙。我们可以利用统计技术发现在siRNA序列里其实也存在一定的规律,比如在某些特定的位点上有一些碱基出现的频率会更高。现在有许多计算机程序可以帮助我们找出一个基因里最适合成为RNA干扰靶标的序列。人工神经网络(artificial neural network)就是这些程序中的一个。目前,它已被用来开发人体全基因组siRNA文库,而且它已经成功地为34个靶基因设计出了有效的siRNA沉默分子。

我们在人工合成siRNA分子时通常都会引入各种化学修饰,比如有选择性地添加磷硫酰键(phosphorothioate linkage),或者将某个位点的2'核糖(2' ribose)替换成2' 氟嘧啶(2' fluoropyrimidine)或2'-O-甲基(2'-O-methyl)。这些修饰都不会影响siRNA的沉默活性,而且还能增强siRNA分子对核糖核酸酶的抵抗性,这一点对于体内应用来说非常重要。在siRNA双链分子中,随从链上的一个2'-O-甲基基团就能够完全抑制Toll样受体的活化,从而阻止I型干扰素信号通路激活对细胞造成伤害。最近研究证实,FANA(fluoro-β-d-arabinonucleic acid)或4?-S-FANA以及ANA(arabinonucleic acid)修饰可以增强siRNA分子在血清中的稳定性,同时还能提高其基因沉默效能。还有一些化学修饰也具有非常重要的作用,它们能够减弱,甚至完全抑制随从链的作用,从而降低脱靶作用的特异性。另外一些修饰,比如添加一个十二烷酸(auric acid)、石胆酸(lithocholic acid)或者胆固醇衍生物则能够增加细胞对siRNA分子的摄取量,而这正是阻碍RNA干扰技术进入实际应用的一大难题。

编辑: helen

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