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miRNA研究解决方案
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miRNA表达量差异分析
miRNA功能获得
miRNA功能缺失
miRNA功能回复与确证
小RNA分子生物合成的结构学信息
siRNA和miRNA分子的生物合成需要细胞在核酸内切酶的作用下对dsRNA前体分子进行切割。细胞内长dsRNA分子可能是RNA病毒的复制产物，也可能是细胞自身基因或者其它外源性的遗传物质的转录产物，还有可能是细胞内各种转录产物自身退火配对而成的产物。Dicer这种核酸内切酶属于RNaseIII家族，它能够将上述长dsRNA分子切割，形成长约21~25 nt的双链siRNA分子。而miRNA则源自各种细胞能够形成茎环结构的内源性的转录产物前体分子，即pri-miRNA（背景知识框1）。另一种属于RNaseIII家族的核酸内切酶Drosha可以在核内切割pri-miRNA分子当中的发夹结构，不过如果这种pri-miRNA分子没有在核内得到切割，转移到胞质当中之后，分子中的发夹结构就会在另一种核酸内切酶Dicer的作用下进行切割，形成长约21~25 nt的miRNA-miRNA*双链分子。其中miRNA链是反义链，也被称作向导链，miRNA*链是正义链，也称随从链。
siRNA和miRNA之所以能被有效地装载进RISC复合物，主要因为它们的两大特征：dsRNA分子的长度和它们在5’端和3’端的特征，即分别在dsRNA分子的5’端和3’端各有一个单磷酸基团和一个突出的双核苷酸单链结构。最近对原核生物RNaseIII和真核生物Dicer酶进行的结构研究结果，向我们揭示了siRNA和miRNA分子的上述这两大特征是如何在Drosha和Dicer酶的作用下产生的。
1.1 RNaseIII家族
负责切割dsRNA的是RNaseIII家族蛋白，包括Drosha和Dicer。RNaseIII家族蛋白切割dsRNA之后会生成特征性的末端，即在5’端有一个单磷酸基团，在3’端有一个两个核苷酸突出的单链末端。我们在原核生物和某些真菌中发现了最简单的RNaseIII酶。这些酶含有一个RNaseIII结构域（该结构域具有催化活性），（通常还有）一个dsRNA结合结构域（dsRBD）（图1a）。这些RNaseIII酶以同源二聚体形式发挥作用。在RNaseIII酶同源二聚体中，两个RNaseIII结构域会形成一个“处理中心”，其中每一个结构域负责水解dsRNA中的一条链。和这些最简单的RNaseIII酶不同，Drosha蛋白和Dicer蛋白都是单体蛋白，都含有两个首尾相连的RNaseIII结构域和一个dsRBD结构域。
图1b中向我们展示了原核生物超嗜热菌（Aquifex aeolicus）来源的最简单的RNaseIII蛋白与一个已剪切的dsRNA产物组成的复合物的晶体结构。从图中可以看出两个催化结构域组成的同源二聚体形成了一个浅浅的裂隙，将两个活性位点分隔开来。每一个催化中心里都有一组保守的氨基酸残基位点，它们都能够结合一个镁离子。这些RNaseIII蛋白与底物结合时都会发生重构，使得dsRBD结构域能够 “夹住” 位于催化结构域二聚体上方的dsRNA底物。
1.2 Dicer
核酸内切酶Dicer可以将dsRNA底物（即长dsRNA和pre-miRNA）降解成特定长度，通常为21~25 nt的短dsRNA片段，即siRNA和miRNA。除了在C末端有两个保守的RNaseIII结构域和一个dsRBD结构域之外，Dicer的N末端通常还会有一个DEXD/H-盒结构域（DEXD/H-box domain），以及一个小的功能不明的DUF283结构域和一个PAZ结构域（图1a）。Argonaute蛋白也含有PAZ结构域，它们能够特异性地与ssRNA的3’端相结合。
根据我们对单细胞真核生物兰氏贾第鞭毛虫（Giardia intestinalis）的Dicer蛋白晶体结构的研究表明，Dicer酶之所以能够形成特定长度的dsRNA产物是因为它的PAZ结构域和RNaseIII结构域之间具有一种特定的空间排布关系。兰氏贾第鞭毛虫的Dicer蛋白是一种天然的“向下倾斜（trimmed-down）”的酶，它仅由一个PAZ结构域和两个串联排布的RNaseIIIa结构域和RNaseIIIb结构域组合而成（图1a。这种蛋白的结构就好像一把大斧，其中两个RNaseIII结构域组成了“斧子刃”，PAZ结构域则构成“斧子柄”（图1c）。RNaseIIIa结构域和PAZ结构域之间通过一条长（足有整个“斧子柄”那么长）螺旋结构相连。该螺旋结构由Dicer蛋白N末端的扁平结构域形成。两个RNaseIII结构域组成了一个分子内二聚体，这种结构与原核生物的RNaseIII同源二聚体结构非常相似（图1b）。在Dicer蛋白里，每一个RNaseIII结构域活性位点中的四个保守的氨基酸位点都会与两个金属离子相结合，这说明Dicer蛋白会利用“双金属离子”机制（two-metal-ion mechanism）来催化RNA降解反应。这两个金属离子之间的距离为17.5埃米，该距离刚好与dsRNA分子大沟的距离相吻合。研究dsRNA与Dicer蛋白结合过程后我们发现，dsRNA分子沿着Dicer蛋白N末端的扁平结构域形成的扁平表面移动，然后与Dicer蛋白里带有金属阳离子的氨基酸残基位点发生静电相互作用。如果这些位点发生突变，就会影响到Dicer蛋白对dsRNA的酶切活性。这说明这些带正电荷的氨基酸位点是Dicer蛋白与dsRNA底物之间相互结合的关键因素。
Dicer蛋白的PAZ结构域与后面将会介绍到的Argonaute蛋白的PAZ结构域具有相同的折叠形式和3’端突出的氨基酸残基结合位点。这个3’端突出的氨基酸残基结合位点和RNaseIIIa结构域之间的距离为65埃米，这段距离刚好与25 nt的RNA分子的长度相当（图1c）。而兰氏贾第鞭毛虫的Dicer蛋白在体外反应中生成的siRNA产物的长度刚好就是25 nt。Dicer蛋白所具有的这种结构特征刚好就是一把“分子尺”，被这把尺“裁剪”出的产物的长度刚好符合要求。Dicer蛋白首先将dsRNA底物因为非特异性切割而产生的3’端二核苷酸与其自身的PAZ结构域相结合，然后根据自身的“分子尺”长度在dsRNA固定位置处进行切割，形成小RNA分子的5’端。这种机制已经被兰氏贾第鞭毛虫Dicer蛋白缺失了PAZ结构域的截短体试验所证实。在体外实验中发现，缺失了PAZ结构域的兰氏贾第鞭毛虫Dicer蛋白能够生成长度各异的小RNA产物，而不是固定长度的小RNA产物。根据兰氏贾第鞭毛虫Dicer蛋白的晶体结构研究表明，蛋白中那段非保守的链接螺旋结构的序列长度是决定小RNA产物分子长度的关键，这可能就是导致不同物种小RNA分子长度之间各有差异的原因。
我们最近才解析了仅仅只有RNaseIIIb和dsRBD这两个结构域的小鼠Dicer蛋白片段的晶体结构。研究发现，在小鼠Dicer蛋白与底物分子结合时，dsRBD结构域会发生在原核生物RNaseIII中观察到的那种构象改变现象。另外，我们在体外试验中还发现，缺失了dsRBD结构域的人体Dicer蛋白的截短体对RNA底物的切割能力也会大大降低，但是其底物结合能力不会受到影响。大部分Dicer蛋白都含有一个DEXD/H盒结构域。这些结构域广泛见于各种参与依赖ATP的核酸结合或重构反应的蛋白质间。虽然有一些无脊椎动物的Dicer蛋白，比如黑腹果蝇的DCR-2蛋白等似乎也需要ATP的帮助来完成长链dsRNA底物切割反应，但是哺乳动物的Dicer蛋白似乎并不需要ATP的参与。对野生型和突变型人Dicer蛋白进行酶切动力学分析，结果表明DEXD/H盒结构域可能具有自我抑制功能（auto-inhibitory function），因为如果去掉这个结构域会加快酶切速度。这说明DEXD/H盒结构域使得Dicer蛋白形成了一种不利于酶切反应进行的构象，因此必须在进行酶切反应前改变这种构象。我们还需要对全长Dicer蛋白与其底物共同形成的复合体的结构和生化功能进行更加深入的研究，这样才能发现DEXD/H盒结构域在小RNA分子与RISC复合体结合时是否真的参与了Dicer蛋白和底物的结合反应以及底物dsRNA分子的解旋反应。
图1 RNaseIII家族蛋白结构图
a、RNaseIII家族蛋白结构域结构示意图。
b、在dsRNA与原核生物RNaseIII相结合时互相诱导契合模式图。图中所示为I类RNaseIII同源二聚体分子。图中左侧表示的是海栖热袍菌的RNaseIII蛋白（PDB数据库查询序列号1O0W）在没有与RNA底物结合时的晶体结构。图中右侧表示的是超嗜热菌的RNaseIII（PDB数据库查询序列号2EZ6）在与RNA底物结合时的晶体结构。图中蛋白结构域的颜色与a中标注一致，RNA底物以金色表示。镁离子以紫色小球表示。图中箭头所示为酶切作用位点。在这些模式图中，我们可以清楚看到蓝色标注的dsRNA结合结构域，即dsRBD结构域在与底物结合时会发生明显的旋转。
c、兰氏贾第鞭毛虫Dicer蛋白切割dsRNA底物机制模式图。图中左侧所示为兰氏贾第鞭毛虫Dicer蛋白（PDB数据库查询序列号2FFL）晶体结构，右侧为结合了RNA底物之后的复合体结构。在该模型中，RNA底物的3’端突出序列与Dicer蛋白的PAZ结构域相连接，然后在65埃米距离处被切割，形成产物的5’端。图中图片均使用PyMol（http://www.pymol.org）软件制成。
1.3 Drosha蛋白和“微处理器复合体”
作为RNaseIII家族成员的Drosha蛋白可以催化pri-miRNA分子起始处理步骤，生成pre-miRNA分子。pre-miRNA分子呈发夹结构，它的5’端有磷酸化修饰基团，3’端有二个碱基的部分突出单链。Drosha蛋白是一种核蛋白，它由富含脯氨酸的区域以及富含精氨酸和丝氨酸的区域组成的N末端和两个RNaseIII结构域和一个dsRBD结构域组成（图1a）。纯化的Drosha蛋白可以非特异性地切割dsRNA，它必须在名为“微处理器复合体（microprocessor complex）”中的DGCR8蛋白（即无脊椎动物体内的PASHA蛋白）的辅助下才能特异性地切割pri-miRNA分子。DGCR8蛋白能够与pri-miRNA分子中形成发夹结构的碱基结合，帮助Drosha蛋白定位到酶切位点处，即pri-miRNA分子茎部距离位于双链茎部和侧翼ssRNA序列之间的连接部位的11bp处。因此，DGCR8蛋白似乎是一个反式作用决定因子（trans-acting specificity determinant），其作用类似于Dicer蛋白里的PAZ结构域，只不过PAZ结构域是顺式作用因子。我们现在还不清楚Drosha蛋白的分子结构，但是由dsRBD结构域串联组成的人类DGCR8蛋白核心区域的结构最近已经得到了解析。研究发现，该核心区域里与RNA结合的两个dsRBD结构域的结合表面是不连续的，这说明DGCR8蛋白是分别与pri-miRNA分子茎环结构中不连续的两个部分结合的。
编辑: helen
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