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miRNA研究解决方案
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miRNA表达量差异分析
miRNA功能获得
miRNA功能缺失
miRNA功能回复与确证
Argonaute蛋白结构与功能之间的关系
RNA干扰以及所有由小RNA分子介导的基因表达沉默机制都有一个共同的特点，那就是会有一个负责沉默作用的小RNA分子（在本文中我们称这个分子为向导链）与Argonaute家族蛋白发生相互作用。这种RNA-Argonaute蛋白复合体就构成了RISC复合体里最基本的，也是最为核心的效应元件。在RISC复合体中，小RNA分子起到这样的作用：通过碱基互补配对原则，以序列特异性的方式引导Argonaute蛋白与靶标分子结合。mRNA的这些靶标分子被Argonaute蛋白识别之后会被切割或者抑制翻译，最终被细胞降解。
Argonaute蛋白在进化过程中演变出了各种亚科蛋白。这些亚科蛋白可以识别各种不同类型的小RNA分子，从而在各种小RNA沉默途径中发挥作用。siRNA和miRNA都能与Argonaute亚科蛋白AGO蛋白结合，但是piRNA则与Argonaute亚科蛋白PIWI蛋白结合。在经典的由siRNA分子介导的RNAi途径中，Argonaute蛋白可以用内切核酸酶活性来沉默mRNA靶分子，这种过程被称作切割。在生殖细胞中，面对各种外来的遗传物质，Argonaute亚科蛋白PIWI蛋白在piRNA介导的RNA沉默途径中，利用的也是切割机制。在进行切割反应时，目标RNA分子主要在磷酸基团处被切割，该处主要是对应向导链5’端开始第10和第11位碱基处磷酸基团处的位点。只有向导链和靶标链在切割位点处互补情况非常好，切割反应才能发挥作用。Argonaute蛋白也可以不依赖切割反应来达到沉默RNA的目的。在动物细胞的miRNA沉默途径中，Argonaute蛋白可以通过抑制目的mRNA翻译的办法，以及诱导目的mRNA发生脱腺苷化作用（deadenylation）后降解的方法来达到基因沉默的作用。不过，有关miRNA介导基因沉默的精细机制我们现在还不是非常清楚。
作为小RNA介导基因沉默途径里的效应分子，Argonaute蛋白必须要能够在与siRNA 双链或miRNA-miRNA*双链分子结合时准确识别出小RNA向导链并与之结合，剔除掉没有功能的随从链和miRNA*链，然后依照向导链的指引发现目的RNA（背景知识框1）。在需要RNA切割机制参与的沉默途径中，Argonaute蛋白会被多次循环利用。在Argonaute蛋白循环识别靶标分子，进行切割反应，释放出产物的过程当中，向导链继续与Argonaute蛋白结合，不会脱离。在多细胞动物miRNA的沉默途径里切割机制是通过一种不需要“切割机”的形式（slicer-independent manner）来发挥作用的，此时的Argonaute蛋白需要一直与靶标mRNA分子紧密结合，这样才能阻止其翻译。
1. 功能结构域
Argonaute蛋白都是多结构域蛋白，其含有N末端结构域、PAZ结构域、MID结构域和PIWI结构域（图2a）。原核生物Argonaute蛋白的晶体结构表现出一个二叶状（bilobate）结构。MID结构域和PIWI结构域形成其中一叶，而N末端结构域和PAZ结构域形成另一叶（图2b）。Argonaute蛋白家族里的两个标志性的结构域——PAZ结构域和C末端的PIWI结构域最初都是用系统发生序列分析（phylogenetic sequence analysis）的方法发现的。对黑腹果蝇Argonaute蛋白中分离出来的PAZ结构域进行三维结构解析的结果表明，PAZ结构域的折叠情况比较类似于低聚糖/低聚核苷酸结合折叠结构域（oligosaccharide/oligonucleotide-binding-fold domain）和Sm折叠结构域（Sm-fold domain）的情况。我们得到的第一个全长Argonaute蛋白的晶体结构是极端嗜热菌（Pyrococcus furiosus）来源的Argonaute蛋白的晶体结构。该结构显示，曾被Lorenzo Cerutti等人认定为PIWI结构域的序列基序实际上是由MID结构域和PIWI结构域共同组成的。这两个结构域由被遮盖的Argonaute蛋白C末端中心部位非常保守的位点连接起来（图2b）。MID结构域与lac抑制子里的糖结合结构域比较相似。PIWI结构域的折叠方式则与切割RNA–DNA杂交分子的核糖核酸内切酶RNaseH比较类似。古细菌闪烁古生球菌（Archaeoglobus fulgidus）里的PIWI样蛋白Piwi的晶体结构表明该蛋白是由两个结构域组成的，即结构域A和结构域B，分别对应于MID结构域和PIWI结构域。超嗜热菌（A. aeolicus）的全长Argonaute蛋白的PIWI结构域也具有RNaseH样折叠情况。生化研究表明，原核生物的Argonaute蛋白和RNaseH一样，可以起到DNA引导的核糖核酸酶（DNA-guided ribonuclease）作用，而真核生物的Argonaute蛋白则具有RNA引导的核糖核酸酶（RNA-guided ribonuclease）作用。
2. 切割活性
Argonaute蛋白的PIWI结构域具有RNaseH样的折叠情况，这说明Argonaute蛋白应该是具有切割活性的。和RNaseH酶一样，Argonaute蛋白同样也需要二价金属离子的辅助来完成切割反应，从而生成3’端是自由羟基基团的RNA产物的5’端，和5’端是磷酸基团的RNA产物的3’端。RNaseH酶的活性位点包括一个天冬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸/天冬氨酸基序（Asp-Asp-Glu/Asp motif），而且正是这段基序与二价金属离子结合。同样，在极端嗜热菌Argonaute蛋白Ago的晶体结构中，我们也发现了镁离子，和与这个离子结合的天冬氨酸-天冬氨酸-组氨酸基序（Asp-Asp-His motif）（图2b）。在体内和体外实验中，将人体AGO2蛋白中的这段基序突变掉后证实了它对Argonaute蛋白切割功能的重要性，这也证明了Argonaute蛋白是RISC复合体发挥切割作用的关键元件。我们对粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）RITS复合体组分Ago1蛋白进行了类似的研究，结果发现Ago1蛋白的切割活性是完成转录沉默的关键。在AGO1、AGO2、AGO3和AGO4这四个人体Argonaute蛋白中，只有AGO2蛋白表现出了切割活性。AGO1蛋白和AGO4蛋白中的基序都和那段保守的天冬氨酸-天冬氨酸-组氨酸基序不同，不过AGO3蛋白含有这段保守序列，但是AGO3蛋白在体外试验中仍旧没能表现出切割活性。但是，最近有人发现含有天冬氨酸-天冬氨酸-组氨酸基序的黑腹果蝇PIWI蛋白表现出切割活性，这说明PIWI蛋白在piRNA沉默途径里具有重要作用。黑腹果蝇AGO1蛋白和AGO2蛋白都有完整的天冬氨酸-天冬氨酸-组氨酸基序，也都具有切割活性。不过，AGO1蛋白的酶切效率要远远低于AGO2蛋白，这是因为AGO1蛋白释放产物的速度要远远低于AGO2蛋白，因而循环作用的速度也较慢。这些研究成果都表明，除了那段重要的序列之外，还有很多其它的因素都能够影响到体内Argonaute蛋白的切割效率。
Argonaute蛋白分子结构示意图
a、真核生物的Argonaute蛋白具有四个结构域：N末端、PAZ结构域、MID结构域和PIWI结构域。在某些情况下要特别注意闪烁古生球菌（Archaeoglobus fulgidus） Piwi蛋白的结构。其中MID结构域和PIWI结构域分别表示为结构域A和结构域B。
b、结合了Mn2+ 离子的嗜热古菌（Pyrococcus furiosus）Argonaute蛋白Ago（PDB数据库查询序列号1Z25）的晶体结构示意图。该蛋白结构分为两部分，其中蛋白的N末端和PAZ结构域形成一部分，MID结构域和PIWI结构域则形成另外一部分。结合在活性位点处的金属离子以紫色小球表示。在酶切活性位点处与金属离子结合的氨基酸残基位点以小柱状结构表示。
3. 识别RNA分子的末端
在siRNA和miRNA分子掺入RISC复合体的过程中需要对其5’端的磷酸基团和3’端的突出碱基进行处理。研究发现PAZ结构域具有RNA结合作用，它尤其能够识别ssRNA的3’端，这说明在RISC复合体中它可能起到了将向导链的3’端铆定起来的作用。对结合了siRNA样双链结构的人AGO1蛋白PAZ结构域晶体结构的解析，以及对结合了ssRNA寡核苷酸分子的黑腹果蝇AGO2蛋白PAZ结构域进行的磁共振结构的研究让我们能够对RNA识别机制进行更深入的研究。在这些结构当中，我们发现RNA分子3’端突出的碱基插入了PAZ结构域中一个沿保守的芳香族氨基酸残基形成的疏水口袋（图3a）。虽然这种相互作用缺乏序列特异性，但是3’端突出的末端碱基的确是与保守的苯丙氨酸残基上的芳香族环发生了相互作用。
Argonaute蛋白PAZ结构域和MID结构域识别小RNA分子末端机制模式图
a、人AGO1蛋白PAZ -RNA复合体晶体结构图（PDB数据库查询序号为1SI3）。图中带状结构为人AGO1蛋白PAZ结构域，小棍状结构为siRNA样双链分子。AGO1与RNA 3’端结合的保守氨基酸残基位点以小棍表示。siRNA 3’末端插入了AGO1的疏水口袋之中，其中3’端突出的碱基插入了第292位苯丙氨酸的芳香环。
b、闪烁古生球菌Piwi -RNA双链分子复合体晶体结构示意图（PDB数据库查询序号为2BGG）。该dsRNA模拟了向导链与靶标链之间的相互作用。如图所示，闪烁古生球菌Piwi蛋白由MID结构域（结构域A）和PIWI结构域（结构域B）组成。图中红色骨架结构显示向导链5’端碱基与MID-PIWI结构域于交界处结合，它并不与蓝色的靶标链配对。
c、详细展示了闪烁古生球菌Piwi蛋白中与小RNA分子5’端结合的口袋结构。与Piwi蛋白C末端第427位亮氨酸和小RNA分子5’端结合的镁离子以紫色小球表示。图中小棍状结构表示的是Piwi蛋白中能够与镁离子和小RNA分子5’端结合的保守的氨基酸残基位点。Phe：苯丙氨酸；Lys：赖氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；Gln：谷氨酸；Arg：精氨酸； Gln：谷氨酸；Leu：亮氨酸；
siRNA和miRNA分子5’端的磷酸基团是这些小RNA分子合成时形成的。这些磷酸基团对于siRNA和miRNA分子掺入RISC复合体也起到了至关重要的作用。而且这些5’端的磷酸基团还保证了切割反应的保真性，因为靶RNA上的切割位点是由它到向导链5’端磷酸基团的距离决定的。与一短链dsRNA（该结构模拟了RISC复合体中的向导链-靶标链双链结构）结合的闪烁古生球菌Argonaute蛋白Piwi的晶体结构表明，向导链5’端的碱基被扭曲了，因而无法与靶标链互补配对（图3b）。这也刚好可以解释我们观察过的现象，即如果该位点发生了碱基错配也不会带来什么严重后果，反而可能会增强切割活性。向导链5’端的磷酸基团被深埋在MID结构域与PIWI结构域形成的口袋当中。在这里，它与一个镁离子结合，并且还与Argonaute蛋白的C末端相互作用（图3c）。如果四个金属离子结合位点以及5’端磷酸基团结合位点中的任何一个位点（这些位点都是Argonaute家族蛋白中最为保守的位点）发生突变，就会影响到Argonaute蛋白的切割活性。这也说明了Argonaute蛋白这个5’端磷酸基团结合口袋在铆定向导链过程中发挥了重要作用。
在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，各种不同类型的非编码小RNA分子的5’端与各种不同的Argonaute蛋白相结合。拟南芥的AGO1蛋白主要与5’端是尿嘧啶的小RNA分子结合，而AGO2蛋白则主要招募5’端是腺嘌呤的小RNA分子。使用异源嵌合体蛋白进行的结构域交换试验（Domain-swap experiment）发现，Argonaute蛋白对小RNA分子5’端的碱基特异性是由MID结构域和PIWI结构域决定的。同样，主要与piRNA结合的PIWI蛋白比较倾向于结合第一个碱基是尿嘧啶的piRNA分子。因此，分别负责与不同小RNA分子结合的Argonaute蛋白的MID结构域和PAZ结构域可能是Argonaute蛋白在进化过程中不断适应的结果，这样小RNA分子可以根据其5’端和3’端被Argonaute蛋白分选。
4. RISC复合体装载过程
在siRNA和miRNA介导的基因沉默途径里，向导链与Argonaute蛋白的结合过程与向导链自身的合成过程紧密相连（背景知识框1）。最初，Dicer蛋白切割dsRNA，生成siRNA双链或miRNA-miRNA*双链产物，这些产物分子中5’端的热稳定性较差的那条链就是向导链。根据结合了siRNA样双链分子的闪烁古生球菌Piwi蛋白的晶体结构分析，我们发现向导链上的第一个碱基深埋在Piwi蛋白5’端磷酸基团结合结构域口袋里，不参与双链RNA分子配对，这说明这种向导链结合模式是高选择性的。Argonaute蛋白也可以促进这个选择过程，因为它能够降解随从链，促进其释放。不过，对于具有多个错配位点的RNA双链分子（这种情况在miRNA途径中比较常见）来说，它们不需要与Argonaute蛋白结合也能被切割。因此，AGO1、AGO3和AGO4等缺乏切割活性的人Argonaute蛋白同样能够结合miRNA分子。
RISC复合体装载过程发生在RISC装载复合体里。在人体细胞中，RISC装载复合体是由Argonaute蛋白、Dicer蛋白和含有dsRBD结构域的TRPB蛋白组成的。在体外实验中，这种三聚体可以切割pre-miRNA分子，装载正确的向导链，并切割目的RNA分子，所有这一系列反应都不需要ATP的参与。那么，TRPB蛋白在RNA分选和RISC装载过程中发挥了什么作用呢？在黑腹果蝇中，DCR-1蛋白能够与含有dsRBD结构域的LOQS蛋白结合，将pre-miRNA分子切割生成miRNA-miRNA*产物。而DCR-2蛋白与含有dsRBD结构域的R2D2蛋白组成的复合体则可以生成siRNA产物，并将它们装载到AGO2蛋白上。最近的研究表明，在黑腹果蝇中，siRNA和miRNA前体双链分子的结构和碱基配对的程度（即有无错配情况发生）都会决定向导链是否能够与AGO1蛋白或AGO2蛋白结合。DCR-2–R2D2复合体对配对精确的小RNA产物亲和力较高，这也就是在AGO2蛋白装载时表现出的小RNA分选效应的作用机制。
5. 靶标确认
闪烁古生球菌Piwi蛋白-RNA复合体晶体结构里，向导链-靶标链双链分子位于一个保守的碱性通道里，这个通道横跨MID结构域和PIWI结构域表面（图3c）。从结构图中我们可以看出，向导链上的第2~ 6位碱基序列暴露在外，它能够与靶标RNA分子配对。以往大量的计算机模拟实验和生化实验也都表明，向导链上的第2~ 8位碱基序列（即种子区域）是决定靶标识别特异性的重要区域，这与结构分析结果比较吻合。我们将靶标RNA上磷酸化位点所对应蛋白的酶切位点，对全长siRNA-靶标双链分子进行建模分析发现，特异性的酶切就发生在距离向导链5’端固定距离处的靶标分子上。只有在这个区域双链分子配对良好，才能进行酶切反应。根据模型推测，切割位点应该是位于第10~11位碱基处。
在全长Argonaute蛋白所形成的二叶结构内，向导链-靶标链双链分子与一个带正电荷的裂隙结合在一起，这个裂隙位于由PAZ-N末端结构域所形成的一叶结构和由MID-PIWI结构域所形成的另一叶结构之间。最近对结合了向导DNA链的全长极端嗜热细菌（Thermus thermophilus）Argonaute蛋白晶体结构进行了分析，结果发现了向导链与靶标链之间相互确认的分子机制。该Ago蛋白与一个5’端有磷酸化修饰的21 nt长的DNA结合形成了复合体，向导链以其5’端磷酸化基团与Ago蛋白的MID结构域结合，以其3’端与Ago蛋白的PAZ结构域结合（图4a）。通过与保守的精氨酸残基相互作用，向导链上第2~10位碱基形成了一个折叠的螺旋结构。因此，向导链种子区域提前与靶标链进行碱基配对（图4a）。在缺失靶标链时，向导链的第10、11位碱基是扭曲的，这说明在发现、确认靶标链时，向导链还会经历一个重构过程。
最近，在靶标链识别机制方面取得的进展来自极端嗜热细菌Ago蛋白、21 nt向导DNA链和20 nt靶标链组成的复合体的晶体结构信息，其中向导链和靶标链在第10~11碱基处有错配（图4b）。向导链和靶标链的末端分别都与各自的结合位点铆定在一起，这样就形成了Ago蛋白-向导链-靶标链复合体。向导链中的种子区域会通过Watson–Crick碱基配对原则与靶标链结合，形成一个A型螺旋结构。Ago蛋白为了适应装载于中心裂隙里的靶标RNA分子，也会发生一次明显的构象改变，形成一个更为开放的构象。这主要是通过旋转其N末端结构域和PAZ结构域，使它们远离MID结构域和PIWI结构域完成的。
图4 Argonaute蛋白识别向导链和靶标链过程示意图
a、极端嗜热细菌Ago蛋白-21 nt 5’端磷酸化修饰向导链复合体晶体结构示意图（PDB数据库查询序号为3DLH）。图中带状结构表示Ago蛋白，小棍状结构表示DNA链。图中可以见到以小棍状结构表示的DNA向导链上第1~11和第18~21位核苷酸。向导链5’端的磷酸化基团与Ago蛋白的MID结构域结合，3’端与Ago蛋白的PAZ结构域结合。
b、极端嗜热细菌Ago蛋白-21nt 5’端磷酸化修饰向导链-20 nt RNA靶标链复合体晶体结构示意图（PDB数据库查询序号为3F73）。图中所示结构方向与图a中保持一致，只不过加上了PIWI结构域。图中蓝色的靶标RNA分子和灰色的向导DNA分子都以小棍状结构表示。箭头表示结合了靶标RNA分子的PAZ结构域和N末端结构域正在发生的构象变化。
c、有关Argonaute蛋白与靶标分子识别的两种模型。尾部固定模型认为向导链的两端在Argonaute蛋白进行切割时都会保持与Argonaute蛋白的结合状态。二步模型认为向导链中的种子区域会发生二步变化。第一步，与靶标分子配对，发生核形成；第二步，促使更多的向导链序列与靶标链序列配对，致使向导链的3’端与PAZ结构域解离。
我们现在已经有了Argonaute蛋白识别并切割靶标RNA分子的两种模型，即尾部固定模型（fixed-end model）及二步模型（two-state model）。
目前，我们还不清楚极端嗜热细菌的Ago蛋白三聚体是否就是一个尾部固定模型里需要的那种具有切割活性的复合体，还是二步模型里描述的那种具有中间状态的复合体。我们还需要对与向导链-靶标链配对良好的双链结构结合的不具备酶切活性的Argonaute蛋白的晶体结构进行深入研究，这样才能彻底解决这个问题。不过无论如何，我们在极端嗜热细菌的Ago蛋白三聚体模型里观察到的靶标识别过程，都可以代表多细胞生物体内发生的miRNA介导的基因沉默途径里靶标mRNA分子识别过程。在miRNA介导的基因沉默途径里通常会因为miRNA-mRNA双链在第10~11碱基处出现的错配而导致沉默机制失效。
6. 不依赖切割反应的功能
在多细胞生物中，miRNA介导的基因沉默途径仅仅只有在含有miRNA的RISC复合体结合了目的mRNA分子之后才会起作用，但在这个途径中是不会对目的分子进行切割的。目前miRNA介导的基因沉默的具体机制尚不明了，但是其中肯定会包括RISC复合体和负责mRNA翻译及降解的细胞器之间的相互作用。最近体外实验证明，miRNA可能会通过干扰EIF4F因子与mRNA 7-甲基鸟苷帽子结构相结合的正常作用而影响翻译的起始过程。人AGO2蛋白的MID结构域具有和EIF4E因子（EIF4F因子亚基）帽结合基序同源的序列（尽管这种同源性比较有限），这说明人AGO2蛋白能够与EIF4E因子竞争mRNA的帽结构。不过，Argonaute蛋白的MID结构域在结构上还缺乏和EIF4E蛋白的同源性。因此，AGO2蛋白和mRNA帽结构之间真的存在一种直接发生的相互作用，那么这可能就是一种新的mRNA识别机制。
Argonaute蛋白、miRNA以及它们的靶标mRNA分子都共同定位于细胞质处理小体（P bodies，是mRNA被降解和退化的部位）当中。在哺乳动物细胞和黑腹果蝇细胞中，Argonaute蛋白和细胞质处理小体蛋白GW182之间的相互作用是miRNA介导的基因沉默途径中的关键步骤，这也是影响到Argonaute蛋白定位的关键步骤。最近发现GW182蛋白富含甘氨酸和色氨酸的基序（GW motif），它可以直接与人Argonaute蛋白的MID-PIWI区域相互作用，还发现由两个GW基序串联组成的名为“Ago钩（Ago hook）”的最小片段也能够完成这种相互作用。有趣的是，能够破坏Argonaute蛋白与GW182蛋白间相互作用的突变位点主要都集中在Argonaute蛋白的MID结构域和PIWI结构域之间的，能够与RNA分子5’端磷酸基团结合的区域。
编辑: helen
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