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1、免疫组化脱片产生的原因？
（1）多聚赖氨酸玻片质量有问题。
（2）组织切的不好，切片机的问题或者切片厚度不均匀。
（3）组织自身有坏死。
（4）片子没烤好，时间短、温度不够。
（5）操作的时候用力甩片会促使粘贴不牢固的组织片脱落。
（6）抗原修复的时候高压时间过长或者放进修复液时手法不好容易导致脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片。
（7）用PBS的时候尽量泡片，不要冲。
2、封闭血清的选择原则是什么？
为了防止组织或细胞切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！实验前应用血清进行封闭。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
免疫细胞化学SP法与SABC法的区别
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。免疫组织化学的方法有多种，其实都大同小异，不同点只是在于显色基团！
SP法
1）脱蜡、水化；
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；
4）PBS洗2～3次各5分钟；
5）抗原修复；
6）PBS洗2～3次各5分钟；
7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS洗3次各5分钟；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分钟；
14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15）PBS或自来水冲洗10分钟；
16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗10～15分钟；
18）脱水、透明、封片、镜检。
SABC法
1）脱蜡、水化。
2）PBS洗两次各5分钟。
3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
4）抗原修复。
5）PBS洗5分钟。
6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
7）滴加Ⅰ抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
8）PBS洗三次每次2分钟。
9）滴加生物素化二抗，20℃～37℃20分钟。
10）PBC洗3次每次2分钟。
11）滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。
12）PBS洗4次每次5分钟。
13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15）脱水、透明、封片、镜检。
二者区别：
sp法是：一抗＋生物素化二抗＋HRP标记的链霉卵白素（HRP标记的亲和素）
酶标亲和素-生物素技术（labelled avidin-biotin technique，简称LAB法）。即用辣根过氧化物酶直接标记avidin，用biotin标记2抗。
关键步骤为3步：
Ag +Ab1 +（Ab2-B）+A★
（A★为HRP标记的卵白素）A★与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。如将该法中的卵白素（avidin）变换成链霉卵白素 （streptavidin），LAB法即成LsAB法，或称SP法。
据认为LAB法比ABC法敏感2~4倍，而LsAB法因streptavidin不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在SP法已趋于取代ABC法而广为应用。
sabc法是：一抗＋生物素化二抗＋abc复合物（是使用前亲和素与酶联生物素现配使用）
亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（avidin-biotin-peroxidase complex technique，简称ABC法）。
关键的程序步骤为3步：
Ag +Ab1 +（Ab2-B）+AB★C 复合物
（Ab2-B 为生物素标记的第二抗体）（B ★为生物素标记的过氧化物酶）AB★C复合物是avidin与酶联biotin 1比1在使用前30min配置，混匀。1个avidin分子结合了3个biotin分子，剩下1个结合点与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。ABC法敏感性更高，比PAP法敏感20~40倍，背景也更清晰。
个人理解：SP法和SABC法相差不大，一般都可以用.
SP法：
一抗+ 生物素标记二抗+ 辣根酶标记链霉卵白素+ 辣根酶底物显色
SABC法：
一抗+ 生物素标记二抗+ 滴加试剂SABC（链霉卵白素+ 辣根酶标记生物素）+ 辣根酶底物显色
比较可知，SABC法SP法在原理上基本是一样的。但由于SABC法第3步有放大作用，所以更灵敏一些.可能会出现用SABC法可以做出结果的，用SP法做不出来.总的来说，个人认为SABC法可能好一些！我自己以及周围的同学以前一般都是选用SABC法！
编辑: gaowei2010
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