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1、免疫组化脱片产生的原因？
（1）多聚赖氨酸玻片质量有问题。
（2）组织切的不好，切片机的问题或者切片厚度不均匀。
（3）组织自身有坏死。
（4）片子没烤好，时间短、温度不够。
（5）操作的时候用力甩片会促使粘贴不牢固的组织片脱落。
（6）抗原修复的时候高压时间过长或者放进修复液时手法不好容易导致脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片。
（7）用PBS的时候尽量泡片，不要冲。
2、封闭血清的选择原则是什么？
为了防止组织或细胞切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！实验前应用血清进行封闭。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
放射免疫分析法原理及操作注意事项
放射免疫分析的原理：就是利用放射性核素标记抗原或抗体，然后与被测的抗体或抗原结合，形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。它又分为两种方法。
一、竞争性RIA，又称传统RIA
主要特点：标记的是抗原。其原理：未知抗原Ag+标记抗原Ag +已知定量抗体Ab标记抗原与抗体复合物AgAb+未知抗原与抗体复合物Ag Ab+游离标记抗原Ag （去除）（未知抗原多，标记抗原与定量抗体结合的复合物就少，表现为负相关）。
临床上甲胎蛋白（AFP），癌胚抗原（CEA），8 一微球蛋白（pz—MG ），铁蛋白（Fer），人绒毛膜促性腺激素p亚单位（HCG-13）等的检测都是竞争性RIA法原理。竞争性RIA法，根据加样顺序与温育次数的区别，反应方式分三种：平衡法，将非标记抗原（被测物与标准品）、抗体、标记抗原依次加入反应管，混匀后一次性温育至反应达到动态平衡，再加分离剂分离B（复合物）与F（游离物）如：AFP，8 一MG，Fer；顺序加样法，先将非标记抗原（被测物与标准品），与抗体在反应管内作第一次温育，待反应达到动态平衡后。加入标记抗原，再作第二次温育后，分离B与F如：CEA；急诊检测法：为临床急需检测结果而提出的反应方式，不等RIA 反应达到动态平衡就终止反应；分离剂的选择有，PEG（聚乙二醇），第二抗体等。
现在一般采用的是：第二抗体与PEG合用的方法，称为双抗体一PEG法。
PEG原理：PEG浓度达到7 一9 时能使抗原一抗体复合物沉淀。
优点：经济，简便，通用。
缺点：重复性差，非特异性结合率高。
第二抗体：第一抗体是可与被测抗原进行特异结合的抗体，来自家兔或豚鼠。用第一抗体为抗原，作用到羊，马身上，产生的抗第一抗体的抗体称第二抗体。第二抗体与第一抗体在适当条件下发生特异性结合，生成分子量很大的免疫复合物（AgAb ×Ab ），能自然沉淀。
优点：分离效果好。非特异性结合率低。
缺点：增加经费投入。需要第二次温育，延长了时间。
所以就产生了两者合用的双抗体一PEG法，它结合了上述两种方法的优点。
二、非竞争性RIA，又称免疫放射分析（IRMA）
主要特点：标记的是抗体。
按反应原理分为两种：
（一）单位点IRMA
其原理：抗原只有一个抗原决定簇，所测的抗原为小分子抗原，Ab+AgAg Ab+ Ab+ ImAd—Ag ImAd—AgAb+Ag Ab（去除）（负相关）：（ImAd—Ag）固相抗原免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原；双位点IRMA：抗原有两个抗原决定簇，所使用的两种亚型抗体在与同一抗原分子结合时互不干扰ImAd—Ab+AgImAd—Ab—Ag+ AbImAd-Ab—Ag- Ab+ Ab（过剩的，游离的）：（ImAd—Ab）固相抗体免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗体。
（二）双位点IRMA，又称双抗体夹心法
从加样测定顺序上看，有三种方法：固相抗体先与未知抗原结合，再与标记抗体结合（正向两步法）。然后去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数；未知抗原先与标记抗体结合，再与同相抗体结合（反向两步法）。然后去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数；未知抗原与固相抗体和标记抗体同时反应（一步法，又称同时加样法）。然后去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数。
这三种方法都生成夹心状的抗体一抗原一抗体复合物，故又称双抗体夹心法。
糖类抗原CA50，CA125就用的是其中的第三种方法（一步法），血清中的未知抗原与固相抗体和标记抗体同时反应，生成夹心状的抗体一抗原一抗体复合物，然后去除游离的标记抗体，测固相抗体一抗原一标记抗体复合物的放射性计数。
三、RIA法的影响因素
pH和离子强度；反应温度，温度一般为37℃，也有45℃，室温，4℃ 冰箱；反应时间，操作中的注意事项：戴手套、防护镜等，将试剂盒从冰箱中取出，室温下放置30 min方可使用。
（1）编号：第一排是标准管：根据标准品浓度由低到高A，B，C，D，E，F，G……；第二排是被测样品1，2，3，4，5，6，……。
（2）加样要准确，移液器的使用（两个档位，一档吸人，二档排出）吸头（一个标本一个吸头，避免互相污染）。加试剂：先看瓶签，再摇匀，最后吸人。（标记物一般为红色，一抗为兰色）。
（3）温育时间要保证：按说明书中所要求的时间温育，可以延长，不能缩短。
（4）分离剂加入：混匀静置时间，可以延长，不能缩短。保证抗原抗体复合物与第二抗体的充分结合。
（5）温度：注意观察水浴箱的水温，误差不能太大，为±1℃ ，室温21℃左右。
（6）离心时间：也应按说明书中所要求来操作，转速一般为3 500r/min。往离心机里放反应管时，尽量让它直立（因为倾斜可能会使液体流出）。吸上清液时，沉淀物在试管底部，真空泵的吸头头部不能直接插人到试管底部中央（会吸走沉淀物，而我们的目的是分离保留沉淀物），应该使吸头贴着试管管壁往下放，并且试管要稍微倾斜，但要在即将插到沉淀物边缘时停止，快速上升取出。少留一点点上清液也可。主要是保证沉淀物完整。
（7）进人免疫计数器测量时，注意观察做出的曲线好坏：是不是需要修改，剔除坏点。
（8）报结果：碰到异常结果，要再次看一看沉淀物是否都在，患者情况如何，结果是否与患者情况相符，方可报出。非竞争性RIA法中，清洗固相包被珠时，清洗次数要严格按说明书中所要求来操作，不得减少。虽然RIA法的影响因素很多，但操作中只要注意上述事项，RIA法的稳定性还是相当不错的。主要是它存在放射污染，这个问题不易解决，影响了它以后的发展，如今电化学发光免疫分析，化学发光免疫分析，酶联免疫分析，磁酶免疫分析等相继推出，发展很快。RIA法将被淘汰。
参考文献：
（1）程绍钧，余裕民.检验核医学[M]。重庆：重庆大学出版社，2003，62—75。
编辑: gaowei2010
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