你知道吗？ 详细 >>
1、免疫组化脱片产生的原因？
（1）多聚赖氨酸玻片质量有问题。
（2）组织切的不好，切片机的问题或者切片厚度不均匀。
（3）组织自身有坏死。
（4）片子没烤好，时间短、温度不够。
（5）操作的时候用力甩片会促使粘贴不牢固的组织片脱落。
（6）抗原修复的时候高压时间过长或者放进修复液时手法不好容易导致脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片。
（7）用PBS的时候尽量泡片，不要冲。
2、封闭血清的选择原则是什么？
为了防止组织或细胞切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！实验前应用血清进行封闭。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
免疫组化常见问题及其解决办法
1、 一抗从4度拿出后，为什么要进行37度复温？
（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；
（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
（3）其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。
2、切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？
全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：
（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4oC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
3、脱片产生的原因有哪些？
（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。
（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。
（3）没烤好，时间短，温度不够之类。
（4）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
（5）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。
（6）一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。
（7）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。
4、免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？（尤其是微波修复）
关于抗原修复，我试过的修复条件有EDTA热修复，柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果来看，微波修复其实很不容易掉片子的，而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起，而微波修复水加热到沸腾，沾在片子上的气泡就会少，不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时，你可以将片子靠的尽量近些，或是在载玻片四周垫些棉花什么的，然后盖上盖玻片，这样修复的话就能够尽量减少载玻片上小气泡的形成。我们用的微波修复条件为：2.94g柠檬酸三钠溶于1000ml的水，调PH值至6.0，微波修复10分钟。你可以试试，时间可以根据需要自己调整。对于柠檬酸修复来说，只要高压修复时间控制在加阀冒气后90秒，冷水下终止开高压锅盖，高压修复和微波修复一样不掉片子，而且一般高压修复效果往往更好一点；关于EDTA热修复，一般说明书上都讲的是PH值等于9，实际上我试过，如果单传用EDTA，很容易掉片子，但是用Tris-EDTA,一般就不会掉片子了，Tris-base的浓度为0.05mmol/L,高压和微波修复都可以，PH也等于9。
5、DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？
着色不均匀可能与你的实验手法有很大关系，可能原因有：
（1）切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。
（2）有可能是你的显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。
（3）如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。
编辑: gaowei2010
以下网友留言只代表网友个人观点，不代表网站观点
