你知道吗？ 详细 >>
1、免疫组化脱片产生的原因？
（1）多聚赖氨酸玻片质量有问题。
（2）组织切的不好，切片机的问题或者切片厚度不均匀。
（3）组织自身有坏死。
（4）片子没烤好，时间短、温度不够。
（5）操作的时候用力甩片会促使粘贴不牢固的组织片脱落。
（6）抗原修复的时候高压时间过长或者放进修复液时手法不好容易导致脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片。
（7）用PBS的时候尽量泡片，不要冲。
2、封闭血清的选择原则是什么？
为了防止组织或细胞切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！实验前应用血清进行封闭。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
从采购到实验——菜鸟成长记
免疫组化以稳定性差著称，过程不难，但是染好却很难。免疫组化“新手”该如何完成从抗体的选择、订购，试剂的配置，实验过程设计，直至获得特异性高，稳定性好的实验结果？也许这篇文章可以给你带来意想不到的收获。
写给免疫组化新手1－抗体订购篇
免疫组化是蛋白质组学方法之一，它是由Nakane在1967年创建的，免疫酶组织化学技术是目前开展免疫组织化学技术最常用的方法。专门用于免疫组化的 抗体多为IgG类单抗，识别抗原的空间构象。所以在购买抗体时一定注意它的用途，是专门用于组化的还是可以有免疫印迹等其它用途。一般说来免疫印迹由于有 变性蛋白的过程，识别的是抗原的线性表位。针对抗原的种属来选择，识别全长的最好。还要考虑包装大小、价格、发货时间、保存温度（稀释的4度，没稀释的 －20度）、保存时间和代理机构权衡，已选好抗体。能够先试用后付款的代理公司最好。腊块最好选5年－10年以内的。一抗订购后需要查阅大量的文献以判断 它的表达部位，是否需要修复等信息。
一抗解决后再说一说二抗，对于科研来说，二步法非生物素标记的抗体是比较好的，可以减少非特异性背景染色。根据一抗的种属决定二抗。鼠、兔或羊的一抗分别 选羊、羊和兔的二抗。根据一抗的种类也可以选鼠兔共用的二抗。生产二抗厂家不同，分装也不同。显色系统不同，步骤也不同。包装不同，价格也不同。大致有 Sino Biological, Invitrogen等。一般来说能有工作液的，最好买工作液；有试剂盒的，最好买试剂盒。
单抗多是鼠源，种植在腹腔的杂交瘤细胞，通过腹水获得，目前国内仅有几家公司自主生产兔源单抗，其特异性更高。 多抗是兔羊源，通过免疫动物，从血清中获得。
介绍两个网站可以查抗体的相关信息：
http://www.exactantigen.com
http://www.biocompare.com
介绍一个网站可以快速获得抗原、RNA定位与功能：
http://www.dsi.univ-paris5.fr/genatlas
写给免疫组化新手2－试剂器材篇
试剂
主要由100％二甲苯，梯度酒精（100、95、75％）、PBS / TBS、3%双氧水、抗体封闭剂、酶底物(DAB常用)、苏木素、盐酸酒精、中性树胶、蒸馏水、柠檬酸修复液等。 各试剂都有成品或包括在试剂盒中，但是如果愿意自己配也很好。
PBS用的是盐酸缓冲对，缓冲能力更强一些，而TBS用TRIS缓冲对，主要用于免疫印迹等实验。抗体封闭剂指BSA或二抗动物的血清，主要使用其中的 IgG，用于封闭组织中能直接与二抗反应的非特异性抗原。而免疫印迹使用BSA或脱脂奶粉主要用其中蛋白封闭膜上未与蛋白结合的空白。组化的封闭剂不能用 奶粉代替，主要因为奶粉中几乎很少有能与抗原结合的IgG。换句话，组化是用抗体封抗原，免疫印迹使用蛋白封空白位置。酶底物DAB: DAB是HRP组化敏感底物，有致癌性，味苦涩。用PBS/TBS溶解后加3%双氧水。配方是：TBS 5 ml+DAB 5 mg+3% H2O2 15 μl 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CBS，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。DAB终浓度为0.05％，H2HO终浓度为0.01％，DAB配方也可以是TBS/PBS 10ml DAB 5mg 3%H2O2 34ul。苏木素分为harris苏木素（速染）和mayer苏木素（缓染，不用分化），可根据实际情况选择。
器材
湿盒：单、双、三排等，根据任务量选择
染色缸（面纱缸）：玻璃或不锈钢，磨口玻璃缸最好
切片架：不锈钢或铜制，不锈钢较好
热修复塑料切片盒和脱水用玻璃染色盒：不能用后者代替前者，否则玻璃会熔化
滴管、加样枪、枪头、ep管、盖玻片、镊子、冰盒等，当然如果用热修复微波炉也是必须的。
写给免疫组化新手3－方式方法篇
免疫组化以稳定性差著称，过程不难，但是染好却很难。
首先是安排好时间，一般至少4个小时的时间才行；但是事先得按说明书的参考稀释浓度稀释抗体，但不完全局限于说明书。
免疫组化有三个对照，阴性对照、阳性对照和空白（PBS）对照，一般用阳性对照摸浓度。阴性对照可以作为控制共染的参照物。
确定好阴性对照和阳性对照后，就要着手搜集标本了。
一般一抗的合适浓度在1:200-1:300左右，但也不绝对有的抗体的反应范围比较宽，甚至可以达到1:1000以上。
固定、脱水、 浸腊 、包埋、 切片 、贴片、 烘烤之后就开始组化的正式步骤了。
首先是脱腊，一般是2个10分钟，接着是三个5分钟梯度酒精水化。之后是5分钟3%过氧化氢（HRP标记者使用），5分钟蛋白封闭（酪蛋白，可选），一抗孵育30-60分（室温）或4度过夜。注意整个过程不要干片，从而使局部试剂浓度过高。
一抗孵育时间稍微长一点影响不大。二抗时间最好按照要求孵育30分钟，不能过夜。抗体孵育后的清洗很关键，清洗的越干净越彻底，背景越清晰。二抗孵育前最 好加非特异性抗体封闭剂，一般是BSA或二抗动物的血清，以免片子上与一抗动物同源的抗原与二抗结合而产生非特异性染色。有的试剂公司还用二抗增强剂，以 增加二抗的敏感性。
下一步就是DAB显色了，DAB可以自己买DAB色源，现用现配，价钱便宜而且效果要比kit中的AB液或ABC液效果好，不易出渣滓而且颜色清澈。但是kit中的DAB省去称量等步骤，相对简单。
DAB显色以及苏木素复染核最好在显微镜下监控，避免时间过长出现共染。Dab显色一般3分钟足以，苏木素依种类不同而不同，缓染者可以染10分钟，速染者适合大批量操作，最好用1%的盐酸酒精（75%）分化一下，使过染或欠染的核染色适中。
对于染核的抗体，可以在不复染核的情况下显微镜下观察，防止染核后分不清核是否着色。最后是梯度酒精脱水（75-95-100%）各10秒钟，蘸二甲苯封 片。此中的酒精和二甲苯均不能与脱蜡和水化的试剂混用，防止其中的蜡再度附着其上。中性树胶封片是个小技术，建议提前到病理科/病理室提前演练一下。风干 后贴标签保存即可。等待用IPP软件进行定量阳性分析。对于染核的抗体也可以用AEC做底物.
编辑: gaowei2010
以下网友留言只代表网友个人观点，不代表网站观点
