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1、免疫组化脱片产生的原因？
（1）多聚赖氨酸玻片质量有问题。
（2）组织切的不好，切片机的问题或者切片厚度不均匀。
（3）组织自身有坏死。
（4）片子没烤好，时间短、温度不够。
（5）操作的时候用力甩片会促使粘贴不牢固的组织片脱落。
（6）抗原修复的时候高压时间过长或者放进修复液时手法不好容易导致脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片。
（7）用PBS的时候尽量泡片，不要冲。
2、封闭血清的选择原则是什么？
为了防止组织或细胞切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！实验前应用血清进行封闭。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
石蜡切片的酶免疫组化注意事项
三. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？
a.也许是抗体本身有问题，因为有很多公司的抗体质量并不好，很容易上背景，可以换一种抗体 试试。
b.如果经费不允许换抗体的话，你可降低抗体的浓度，并随时注意观察显色，在能看到信号的情况下尽量降低背景。
c.可以换一种封闭液，不同的封闭液对某种来源的抗体来说，会有不同的封闭效果。
d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所检测动物组织的正常血清，这样可以去除一部分非特异性染色。
全片着色
全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：
（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会 游离出 氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到 理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组 化染 色，如果将装有切片和修复液的容器放在4?C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太 长。
（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
四. 免疫组化结果老是出现阴性结果？
免疫组化出现阴性结果有可能组织本身就没有信号，也有可能是抗体出了问题。可以找一些阳性组织做一下，以确定是抗体的问题还是组织本身就没有所检测的抗原表达。还有，可以提高抗体的浓度，或者试一试抗原修复等方法，也许会得到意想不到的结果。
五. 一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？
1. 一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；
2. 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
六. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。
关 于抗原修复，我个人的观点和panther75有点不同。我试过的修复条件有EDTA热修复，柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果 来看，微波修复其实很不容易掉片子的，而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起，而微波修复水加 热到沸腾，沾在片子上的气泡就会少，不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时，你可以将片子靠的尽量近些，或是在载玻片四周垫些棉花什么的，然后盖 上盖玻片，这样修复的话就能够尽量减少载玻片上小气泡的形成。
我们用的微波修复条件为：
2.94g柠檬酸三钠溶于1000ml的水，调ph值至6.0，微波修复10分钟。你可以试试，时间可以根据需要自己调整。
七. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？
用石蜡切片做免疫组化是不需要透膜处理的，一是因为石蜡切片比较薄，另外一个原因我认为是在包埋过程中细胞膜已经被破坏，所以这一步可以省略。
八. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？
复 染时间不需要太长，当然这也要根据苏木精的质量来确定，但基本上不要超多一分钟。染色过深的话可以用酸性的水溶液（在水里滴加少量浓盐酸）分色，分色的另 外一个目的是洗掉苏木精在细胞质中的非特异性结合，这样可以使细胞质中的特异信号更明显。所以不管复染是不是过度，分色这一步最好不要省掉。分色后记得再 用氨水返蓝一下。
编辑: gaowei2010
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