核酸抽提的基础(一)
近日打了一个关于核酸抽提的基础现状的草稿；没有去找参考书润色，所以会有点凌乱。首先声明的是：这篇东西只为有一定核酸抽提基础知识的人准备，同时也将会及时修改 （我突然发现了 edit 的功能）。那些分子生物学的过客，最好不要看本文；一是我的思维有点跳跃，二则是没有必要糟蹋自己的时间。
写这篇东西的另外一个原因是，我一直在思考如何简化经典的无介质的核酸抽提程序。最经典的是裂解一步，去蛋白质一步，核酸沉淀一步； DNAzol 将这三步并成了一步，按道理已经简化到了极致。事实是，DNAzol 并没有被大家认可，其原因大概还是质量不太可靠吧。现在也有使用 Proteinase K 消化后直接沉淀核酸的方法，三步简化成了两步，可我总觉得醇的沉淀不可能彻底去除 Proteinase K。明年大概还没有生物学的诺贝尔奖会花落中国的，那么先求得一个核酸抽提最简单的非介质方法世界领先如何？一笑！也一定。
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1、核酸抽提原理
简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。
经典的裂解液几乎都含有去污剂 （如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等） 和盐 （如 Tris、EDTA、NaCl 等）。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 （如 Tris），还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 （如 EDTA）、维持核酸结构的稳定 （如 NaCl） 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 （如 GIT、GuHCl 等） 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。
最常用的纯化方法，一是 PC 抽提 + 醇沉淀，二是介质纯化。第一种方法是利用 PC 对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了 PC 操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。其它杂质 – 如多糖、多酚等 - 的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。
2、了解你的实验样品
如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂时，抽提核酸的实验就会碰到许多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组 DNA，怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了解，才能正确选择裂解方法。
绝大部分情况下，使用新鲜样品可以获得最好的结果。对一些杂质含量高的样品，如果使用新鲜样品抽提基因组 DNA 是碰到杂质残留过大的问题，可以试一下 -20C 保存一天后再抽提的对策，可能会有意想不到的效果。样品如果因为某些原因必须先行保存，也要先简化一下样品：血液最好只保存有核细胞；将样品分割后保存，避免反复冻融。如果实验室不具备合适的保存条件，将样品先裂解后再保存，是一个不错的选择。
3、裂解方法的评价
含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组 DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA “缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组 DNA 与蛋白质 “缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA 的特性占优势，则纯化时以 DNA 的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除，导致 DNA 的损失。有些样品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液 （或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质） ，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。该方法是获得最大得率和最高纯度的基础。
不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。
高浓度蛋白质变性剂 （如 GIT、GuHCl 等） 的裂解方法，是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质 “缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶，从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物，其它绝大部分样品的 RNA 的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。该方法也可用于基因组 DNA 抽提，非常快速简单，但纯度不是很高。
编辑: ludongcn 作者:上海孤儿
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