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兔单抗亲和力和灵敏度更高
相对于鼠单抗（解离常数Kd在10-9-10-10M水平），兔单抗的亲和力可提高100-1000倍（Kd在10-10-10-12M水平）。实际使用时，兔单抗的工作浓度更低，灵敏度更高，因此产生的背景更低，大大降低了假阳性的发生。用作免疫组化等用途时，有时甚至可免去抗原修复的步骤。
兔单抗能识别更多表位
很多蛋白在人类和啮齿动物中同源性很高，这些保守表位在小鼠体内免疫原性很弱，不容易产生高质量抗体。而兔做为宿主，可以更好地识别这些表位，产生针对更多表位的抗体。当然，兔也适合生产针对鼠类蛋白的抗体。
抗体的制备方法与原理
（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测
1．HAT选择杂交瘤细胞 脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓 瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。
在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再 维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期 间，一般每2～3天换一半培养液。
2．抗体的检测 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒 等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。
（四）杂交瘤的克隆化
杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克 隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化 的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生 长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体 的能力。
克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。
1．有限稀释法克隆
（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。
2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。
（3）调整细胞为3～10个细胞/ml。
（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。
（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。
（6）8～9天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。
（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。
（8）每个克隆应尽快冻存。
2．软琼脂培养法克隆
（1）软琼脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640。
①1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。
②0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
（2）用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
（4）1ml 0.5%琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
（5）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。
（6）4～5天 后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。
（7）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。
编辑: wangminchao
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