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兔单抗亲和力和灵敏度更高
相对于鼠单抗（解离常数Kd在10-9-10-10M水平），兔单抗的亲和力可提高100-1000倍（Kd在10-10-10-12M水平）。实际使用时，兔单抗的工作浓度更低，灵敏度更高，因此产生的背景更低，大大降低了假阳性的发生。用作免疫组化等用途时，有时甚至可免去抗原修复的步骤。
兔单抗能识别更多表位
很多蛋白在人类和啮齿动物中同源性很高，这些保守表位在小鼠体内免疫原性很弱，不容易产生高质量抗体。而兔做为宿主，可以更好地识别这些表位，产生针对更多表位的抗体。当然，兔也适合生产针对鼠类蛋白的抗体。
单克隆抗体研制最详细步骤（4）
c. 取出盖片置PBS中用磁力搅拌器洗涤15分钟。
d． 盖片置架上，滴加工作浓度的抗鼠Ig的荧光抗体10-20ul，37℃孵育0.5-1小时。
e． 同法洗涤15分钟；取出盖片，用延缓荧光碎灭的封载剂（如缓冲甘油，9份甘油加1份PBS）封于干净载玻片上。
f. 光显微镜上观察，阳性结果可见特异性荧光（FITC为黄绿色荧光，TRITC为桔红色荧光）。
g. 细胞固定片的制备，也可改在培养板孔中进行，其余步骤同上，在观察结果时，将培养板翻转置于荧光显微镜下，判断标准不变。
C、 细胞的膜荧光染色
完整的活细胞的细胞膜，抗体不能透过。如果细胞在4℃操作，则荧光染色仅限于细胞膜。必须注意死细胞常以非特异性方式吸附大量荧光抗体，因此试验过程中要保证细胞的高活力。活细胞的膜荧光染色大致步骤如下：
a. 制备活性较好的细胞悬液，调节浓度至107个/ml。
b. 在小试管（5×50mm）中加入100ul细胞悬液，再加入100ul待检McAb的样品，混匀，4℃作用30-90分钟。
c. 用洗涤液（PBS 900ml，小牛血清50ml，4%NaN3 50ml）洗二次，每次加洗涤液1-5ml，1000r/min离心5分钟，弃上清。加入100ul荧光抗体，4℃作用30-90分钟。
d. 同法洗涤，将细胞重新悬于20-30ul含10%甘油和10-100ug苯二胺/ml的溶液中；滴加于载玻片上，加盖片封载。
e. 立即在荧光显微镜上检查。
f. 细胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理盐水固定，立即检查，或至少在4℃可保存一周。
⑶ 间接血凝试验
间接血凝试验又称被动血凝试验（PHA），是目前应用较广的检测方法之一。本试验是以包被可溶性抗原的红细胞作为指示系统，当被检抗体与包被在红细胞上的 抗原产生特异性反应时，导致红细胞呈凝集现象。可见，该法具有灵敏、快速、容易操作和无需昂贵仪器等优点，而且经改用醛化红细胞以后，克服原来重复性差的 缺点。
A、 器材和试剂
a. 绵羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。
b. 缓冲液：PBS（PH7.2）；醋酸缓冲液。
c. 甲醛，丙酮醛，NaN3，抗凝剂等。
d. 血凝板，振荡器等。
B、 多糖抗原的间接血凝试验
a. 甲醛化绵羊红细胞的制备：无菌采集绵羊颈静脉血50ml，用枸橼酸钠作抗凝剂；用5倍于红细胞压积的PH7.2 PBS（Na2HPO4??12H2O 3.58g，KH2PO4 0.41g，NaCl 8.01g，蒸馏水1000ml）充分洗涤5次，每次1500r/min 5-10分钟，直至上清测定无蛋白质（用饱和硫酸铵滴定上清，观察有无白色沉淀），再以相同缓冲液配成25%红细胞悬液；将25%红细胞悬液与20%甲醛 以2.5：1的比例混匀，37℃水浴作用2小时，每15分钟振荡一次，红细胞颜色逐渐由鲜红色转变为棕色；以PH7.2 PBS洗涤4次，每次2000r/min 10分钟，再以同样的PBS制成25%红细胞悬液；其后，重复醛化一次，方法同前；最后配成20%醛化绵羊红细胞悬液，加甲醛至0.3%防腐，4℃保存备 用。
b. 脂多糖抗原致敏甲醛化绵羊红细胞的制备：取脂多糖（LPS），以0.2mol/L PH8.0 PB液，调整多糖浓度至120ug/ml，然后100℃水浴处理1小时；将冷却至37℃的热处理LPS与6%醛化红细胞等量混合，37℃搅拌作用45分 钟；取出离心2000r/min 10分钟，以0.01mol/L PH7.2 PBS洗涤4次；配制成4%致敏血球，分装，保存于4℃备用，或冻干保存。
c. McAb的筛选：取待测McAb样品25ul，加入V型微量血凝板孔中，同时设立阴性、阳性对照；再加入0.5-4%致敏红血球悬液25ul，在振荡器上混匀30秒；置室温或37℃ 30-60分钟观察结果。阴性对照孔应呈紧缩的圆点。
C、 可溶性蛋白抗原的间接血凝试验
a. 红细胞醛化：采用双醛法。采绵羊或人“O”型抗凝血，每次加10倍于红细胞压积的PBS洗涤4-6次，然后配成8%红细胞悬液；向此8%红细胞悬液缓慢加 入等量含有3%丙酮醛和3%甲醛的PBS，于室温缓慢搅拌17小时；其后洗涤3次，配成20%双醛化红细胞悬液，加0.1% NaN3防腐，4℃保存备用。
b. 致敏红细胞：取20%双醛化红细胞0.1ml，1500r/min 10分钟，弃上清，沉积红细胞加0.2mol/L PH4.0 醋酸-醋酸钠缓冲液1ml，并加最适浓度（应预先测定，蛋白抗原为50ug/ml左右）的抗原1ml，混匀，于45℃致敏30分钟，有时轻轻摇动，使红细 胞不下沉。然后离心去上清，并用20倍于红细胞压积的PBS洗3-4次，最后用PBS配成0.5-1%致敏红细胞，4℃保存备用。
c. McAb测定：同上法。
⑷ 放射免疫测定
放射免疫测定是用放射性同位素标记抗原或抗体，以检测相应抗原或抗体的定量方法。在筛选和鉴定单抗时常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以检测样品中的McAb，其操作步骤如下：
a. 用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至适宜的浓度（1-100ug/ml），滴加聚乙烯微板孔内，100ul/孔，4℃过夜或37℃ 2小时。
b. 弃去抗原液，每孔加100ul含0.5-1% BSA的PBS，4℃ 1-2小时封闭。
c. 用BSA-PBS洗涤3次，每次3分钟。
d. 加待检样品，每孔100ul，设立阴性孔、阳性孔和空白孔；37℃1-2小时，同法洗涤。
e. 每孔加125I标记的抗鼠Ig抗体工作液100ul，37℃ 1-2小时，同法洗涤。
f. 用γ-射线闪烁计数仪分别测定各孔放射性。通常要求样品孔和阳性对照孔的放射性脉冲分别超过本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性为基准，凡样品孔与阴性孔放射性之比大于3的样品定为阳性。
编辑: wangminchao
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