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兔单抗亲和力和灵敏度更高
相对于鼠单抗（解离常数Kd在10-9-10-10M水平），兔单抗的亲和力可提高100-1000倍（Kd在10-10-10-12M水平）。实际使用时，兔单抗的工作浓度更低，灵敏度更高，因此产生的背景更低，大大降低了假阳性的发生。用作免疫组化等用途时，有时甚至可免去抗原修复的步骤。
兔单抗能识别更多表位
很多蛋白在人类和啮齿动物中同源性很高，这些保守表位在小鼠体内免疫原性很弱，不容易产生高质量抗体。而兔做为宿主，可以更好地识别这些表位，产生针对更多表位的抗体。当然，兔也适合生产针对鼠类蛋白的抗体。
单克隆抗体的标记
目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断试剂（盒）的形式提供，其中核心试剂为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。
一、酶标记
1、辣根过氧化物酶（HRP）标记
辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。
程序一：
（1）将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
（2）加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
（3）加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。
（4）称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。
（5）用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。
（6）将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集第一峰。
（7）酶结合物质量鉴定：
克分子比值测定
酶量（mg/ml）=OD403×0.4
IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62
克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
标记率=OD403/OD280
酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。
（8）HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。
程序二：
（1）将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。
（2）再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色；随后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。
（3）移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。
（4）吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光；加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用7小时。
（5）再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。
（6）用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。
（7）、（8）步骤同程序一。
2、碱性磷酸酶（AP）标记
碱性磷酸酶（AP）用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。其程序如下：
（1）将5mg AP加入1ml抗体溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，于4℃对0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小时，换液三次。
（2）加入2.5%戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次。
（3）换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。
（4）取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。
（5）每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。
3、PAP、APAAP的制备
PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术）、APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术）的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP试剂供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。因为PAP法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。PAP和APAAP试剂的制备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应，调PH至2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化PAP或APAAP。
根据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。
编辑: wangminchao
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