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兔单抗亲和力和灵敏度更高
相对于鼠单抗(解离常数Kd在10-9-10-10M水平),兔单抗的亲和力可提高100-1000倍(Kd在10-10-10-12M水平)。实际使用时,兔单抗的工作浓度更低,灵敏度更高,因此产生的背景更低,大大降低了假阳性的发生。用作免疫组化等用途时,有时甚至可免去抗原修复的步骤。

兔单抗能识别更多表位
很多蛋白在人类和啮齿动物中同源性很高,这些保守表位在小鼠体内免疫原性很弱,不容易产生高质量抗体。而兔做为宿主,可以更好地识别这些表位,产生针对更多表位的抗体。当然,兔也适合生产针对鼠类蛋白的抗体。

抗体纯化:deae-sephadex a-50 柱层析法

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发布日期:2012-04-27 10:37 文章来源:丁香园
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关键词: 丁香园 丁香通 生物专题 义翘神州 抗体纯化   点击次数:

一、原理

deae-sephadex a-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶a-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白。pH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被deae- sephadex a-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通过柱层析,γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。

1、试剂

(1)盐析提取的人γ球蛋白

(2)0.5N NaOH,0.5N HCl 2M NaCl,10%NaN3

(3)DEAE-Sephadex A-50,聚乙二醇(PEG)

(4)0.1M,PH7.4 PB(配制见盐析部分)

2、器材

(1)层析玻璃柱(1.3×40cm),滴定铁架,自由夹,螺旋夹,尼龙纱(200目)

(2)普通冰箱,751桮型紫外分光光度计,电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶),PH计

(3)透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸

(4)量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等

3、操作步骤

(1)deae-sephadex a-50预处理

称deae-sephadex a-50(下称a-50)5g,悬于500ml蒸馏水内,1h后倾去上层细粒。按每克a-50加0.5mol/l naoh 15ml的比例,将a-50浸泡于0.5mol/lNaOH液中,搅匀,静置30min,装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性;再以0.5mol/l HCl同上操作过程处理,最后以0.5mol/l NaOH 再处理一次。处理完后,将a-50浸泡于0.1mol/l pH7.4PB中过夜。

(2)装柱

①将层析柱垂直固定于滴定架上,柱底垫一圆形尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

②将0.1mol/l ,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的a-50。等a-50。等a-50凝胶沉降2~3cm高时,开启出水口螺旋夹,控制流速1ml/min,同时连续倒入糊状a-50凝胶至所需高度。

③关闭出水口,待a-50凝胶完全沉降后,柱面放一圆形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。

(3)平衡

启开出水口螺旋夹,控制流速12~14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度,两者达到一致时关闭出水口,停止平衡。

(4)加样及洗脱

启开上口橡皮塞入下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积2%,蛋白浓度以<100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内, 至与柱面相切时,立即关闭下口,以少量洗脱液洗柱壁2~3次;再放开出水口,使洗液进入床柱,随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液,紧塞柱上口,使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12~14滴/min。

(5)收集

开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3~5ml。共收集10~15管。

(6)测蛋白

以751型紫外分光光度计分别测定每管OD 280nm, 与OD 260nm,按公式计算各管蛋白含量。并以OD 280nm为纵座标,以试管编号为横座标,绘制洗脱曲线。

(7)合并、浓缩

将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并,以peg(mw6000)浓缩至所需体积,加入0.02% NaN3防腐,于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。

(8)a-50凝胶的再生

在柱上先以2mol/l NaCl洗脱蛋白至流出液的OD 280nm<0.02,再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将a-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存;近期不用时,以无水酒精洗2次, 再置50℃温箱烘干,装瓶内保存。

二、注意事项

1、柱的选择:从理论上说,只要柱足够长,就能获得理想的分辨率,但由于层析柱流速同压力梯度有关,柱长增加使流速减慢,峰变宽,分辨率降低。柱的直径增加,使流体流动的不均匀性增加,分辨率明显下降。

2、纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与a-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后,才能进行柱层析。

3、所装的柱床必须表面平整,无沟流及气泡,否则应重装。

4、洗脱过程中应严格控制流速,切勿过快。

5、上样的体积要小,浓度不宜过高。

6、加样及整个洗脱过程中,严防柱面变干。

编辑: wangminchao

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