间充质细胞综述( Mesenchymal Cells)
骨髓基质的生物学特性
骨髓基质由不均一的细胞群体组成，这些细胞包括内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和成骨细胞。人们最早认为骨髓基质只是为造血提供的一个支架而已1。直至最近，人们才清楚地认识到，多种哺乳类动物骨髓中至少存在两种细胞，即造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSC）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）；后者是一群维系非造血骨髓成分的干细胞。MSC，也称多能骨髓基质细胞或间充质基质细胞，是一群贴壁生长、形态类似于成纤维细胞的干细胞。在体外培养条件下，MSC具有自我更新和分化为骨、脂肪和软骨组织的能力2-5。
早在十九世纪六十年代后期，Friedenstein等6就开展了骨髓基质细胞的研究，证明将骨髓单细胞悬液培养，可形成由成纤维样细胞组成的贴壁细胞集落。 此外，他们还发现，这些成纤维细胞集落形成单位（colony-forming unit-fibroblast, CFU-F）具有成骨细胞分化能力，首次提出具有集落形成能力的骨细胞前体细胞的存在6。目前，很多研究者应用CFU-F作为功能指标，以确定某一细胞群体中是否存在基质前体细胞，以及基质细胞前体细胞的频度。人骨髓中CFU-F的频度极低，表明骨髓含有的基质祖细胞量极少7, 8。与体外培养的CFU-F不同，其始动细胞在体内处于增殖静止状态9。上世纪70年代，Dexter对基质细胞功能特点的研究显示，在骨髓长期培养体系中，基质细胞调节HSC的增殖分化和存活1。80年代，Friedenstein和Castro-Malaspina等对基质细胞的形态学和细胞化学特性，进行了较深入的研究，发现这些细胞苏丹黑阳性，碱性磷酸酶阳性，酯酶阴性，IV型胶原阳性，纤连蛋白阳性6-10。
间充质干细胞的分离
人们最早从骨髓中分离MSC。然而，具有MSC特征的细胞也可以从多种组织中分离，包括脐带血、外周血、胎肺和胎肝、脂肪组织、骨骼肌、羊水、滑膜和循环细胞11-17。这些都是血管化的组织，而且越来越多的证据显示，MSC存在于血管周围。因此推测，MSC实质上就是周细胞（pericyte）18。周细胞存在于多种器官的毛细血管和微血管，紧密环绕在内皮细胞的周围18-25。Crisan等人的系统研究证实，MSC和周细胞之间存在密切的联系；而且，无论在人胚胎或成体器官中，周细胞的表型特征为CD146+，NG2+，PDGFR+，ALP+，CD34-，CD45-，vWF-， CD144-25。在生理情况下，周细胞稳固血管，维持组织的动态平衡；当局部组织损伤时，周细胞释放具有营养和免疫调节作用的活性物质，发挥积极的作用26。MSC可以从多种组织中分离，而且，培养的条件在各实验室间迥乎不同，因此，MSC缺乏独特的表型标记。此外，培养基的成分、接种密度和氧分压，都可能影响MSC表型。表1总结了已报道的下述细胞群体的表型特点，包括Pittenger报道的间充质干细胞（MSC）4，Verfaillie小组报告的间叶祖细胞（mesodermal progenitor cells, MPC）27，以及D'lppolito等在低氧分压下培养的骨髓分离的成体可多系诱导细胞（marrow isolated adult multilineage inducible cells, MIAMI）28。尽管对MSC表型报道结果不一，人们普遍认为，无论用什么方法进行分离培养，MSC不表达CD45，CD34，CD11b和CD14等造血细胞抗原，表达SH2 (CD105)，SH3/SH4 (CD73)，CD29，CD44，CD90，CD71，CD106，CD166，STRO-1，GD2和CD146 4, 23, 24, 29-35。
分离与富集MSC是否成功，关键在于细胞贴壁和贴壁后的增殖能力。事实上，选择性培养仍是分离MSC通用的方法。通过Ficoll? 密度梯度离心或阴性筛选，以预富集MSC，是目前最常用的MSC分离技术27, 36。截至目前，没有利用单个表面标记分离MSC的报告，但利用一组表面分子富集MSC是可行的。利用STRO-1单克隆抗体，结合VCAM-1/CD106 29，CD271 37，D7-Fib 38和CD49a 39，可从人骨髓中富集MSC。最近的研究表明，CD271+MSC同时表达PDGFR-?，HER-2/ErbB2 (CD340)和frizzled-9 (CD349) 40。这些标志都不是MSC特异的，也就是说，表达这些抗原的细胞并非都是MSC。
Short和Simmons等对富集小鼠CFU-F的方法，进行了系统的研究，发现小鼠骨实质中MSC含量比骨髓更丰富，骨实质中CFU-F的丰度为2689 ± 58 /106细胞，而骨髓为102 ± 80 /106细胞41。将骨剪碎，酶消化骨片，制备单细胞悬液，之后，通过阴性筛选去除造血细胞，可使CFU-F高度富集41。进一步的流式分析发现，这群间充质祖细胞为Lin-/CD45-/CD31-/Sca-1+42。Bonnet小组利用SSEA-1表面分子，成功地从小鼠骨髓中分离并鉴定了一群原始的间充质细胞43。这群细胞与以往报告的MSC不同，在体外的分化潜能更广泛，能形成胶质细胞、内皮细胞和肝细胞样细胞。另外，在体内，SSEA-1+ 细胞存在于间充质细胞群中，占成年小鼠骨髓Lin-/CD45-/CD31-细胞中的0.04% 43。
氧浓度对培养MSC的影响
小鼠MSC对环境氧浓度十分敏感，在低氧条件下，细胞集落形成能力最高，增殖速度最快（Brenton Short，未发表资料）。其实，对很多细胞类型而言，包括大鼠神经干细胞、成年小鼠骨骼肌卫星细胞、人CD34+骨髓干/祖细胞和大鼠间充质祖细胞等，降低氧浓度，都能促进细胞增殖44-48。氧浓度为5%时，大鼠骨髓间充质祖细胞增殖速度加快，可能与细胞高表达低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）有关；HIF又可上调涉及细胞代谢、增殖和存活的诸多基因表达48，49。低氧对小鼠间充质细胞的扩增尤为重要。
MSC的临床应用价值
最近几年，MSC在组织工程和组织修复中的应用价值，越来越受到人们的注意。动物实验研究证明了MSC的临床应用可能性。Devine等发现，培养的间充质细胞能归巢于灵长类动物骨髓50。诸多动物模型研究显示，体外扩增的人骨髓MSC具有修复动物骨缺损的能力。将培养的人骨髓MSC与多孔生物材料复合，植入后可修复大鼠股骨8毫米缺损。8周后，含MSC的修复组股缺损修复完好，完全治愈；而复合其他细胞对照组未出现修复51, 52。这些研究提示，培养扩增的MSC能定位于损伤局部，并诱导原位成骨。
胎羊移植实验证明用间充质细胞可以促进造血细胞植入。将人骨髓基质细胞与造血细胞共移植，可促进人HSC在胎羊的长期植入53。将未处理的全骨髓细胞移植，也能重建造血微环境系统，提示全骨髓不但含有能重建造血的造血前体细胞，也含有基质前体细胞。Gallotto等的研究表明，在移植后相当长的一段时间内CFU-F的频度一直处于低水平，提示MSC对化疗或放疗损伤十分敏感54。成骨细胞是HSC“龛”主要的细胞成分，因此，移植的MSC可能重建造血微环境。造血干细胞移植后，MSC数量减少，其造血调节能力受到影响，这或许是免疫细胞恢复慢而且细胞组成异常的部分原因55。
间充质细胞具有免疫调节、抑制T淋巴细胞增殖的功能，这是MSC细胞治疗的基础之一。培养的MSC不表达MHC II类分子，且能抑制首次淋巴细胞混合反应。因此，这些细胞能否抑制人体内正在发生的免疫反应，以用于移植物抗宿主病（GVHD）的治疗，也是一个有趣的新课题56。事实上，MSC治疗激素耐药的急性GVHD已经进入临床试验研究。有报告指，8例激素耐药III-IV度急性GVHD病人接受MSC输注后，6例症状完全消失57。临床试验研究证明，培养的异体MSC可以植入患先天性骨发育不良儿童体内58。MSC输注后，多数病例大约一年内病情减轻，骨折发生率下降；但是，随着时间延长，治疗效果逐渐丧失58。这可能与培养传代过程中细胞出现老化和终末分化有关59。细胞在长期培养过程中可能发生了表观遗传变化，导致细胞功能的改变60。研究证实，年龄与MSC体外增殖活性密切相关，随着年龄的增长，MSC增殖能力越差7，8，也提示随着MSC的扩增，其祖细胞池也会逐渐耗竭。MSC功能下降可能是某些疾病的重要因素61, 62，也是老年人骨量减低的原因。
公认的理论认为，成体组织源干细胞，只可能向它所来源的组织分化，如皮肤干细胞形成皮肤，神经干细胞生成神经细胞。与公认的观点不一致，培养的MSC似乎具有更广泛的分化能力。Verfaillie小组的研究表明，体外培养的多潜能成体祖细胞（MAPC）可以分化为神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞63。然而，必须引起大家注意的是，未分化的间充质细胞也表达神经细胞64和平滑肌细胞的标记。因此，当我们解释MSC多胚层细胞分化时，需十分谨慎。间充质细胞治疗修复组织损伤的机制尚不清楚。然而，最近的研究提示，MSC的治疗作用是由于植入细胞的旁分泌机制，而不是由于MSC横向分化为特定的组织细胞65。针对急性心肌梗死66、肺损伤67、肾脏损伤68和神经系统疾病69，研究者正在利用动物模型，开展间充质细胞治疗的有效性研究。相信随着研究的深入，以MSC为基础的组织修复治疗的机制，将会得以逐步阐明。此外，对MSC特定细胞群体生物学特性的详尽了解，阐明不同MSC亚群在组织修复中的具体作用，必将为间充质细胞治疗的临床应用，奠定必要的理论基础。
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