神经干细胞综述
中枢神经系统
成体哺乳动物中枢神经系统主要有三类成熟细胞组成：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，后两者负责细胞间连接，是中枢神经的“通讯”细胞，对维系神经元的功能至关重要。在胚胎发育过程中，中枢神经的发育主要有两个高峰：（1）出生前产生绝大多数的神经元；（2）刚出生后产生成年后绝大多数的星形胶质细胞和少突胶质细胞。一般认为，第二个高峰结束后，中枢神经系统处以分裂静止期，因此，不能修复由于疾病（如神经变性疾病、帕金森氏病、多发性硬化），或创伤（如脊髓损伤或脑缺血性病变）引起的脑组织损伤。
从前，人们对脑修复的研究多倾向于如何在损伤后维持神经元的活性，促进细胞突起延伸，从而建立功能性细胞间连接。这种倾向性基于一个广泛接受的理论：没有证据表明成年脑细胞能够增殖，因此，成年脑细胞不能形成新的脑细胞。然而，在二十世纪九十年代，随着在胚胎和成体脑组织中干细胞的发现，人们认识到以前的理论是不完善的。
中枢神经系统中的干细胞
多能干细胞最简单的定义是：具有无限增殖能力，能够自我更新的未分化细胞；能产生其来源组织多种终末分化细胞。正是干细胞的这些重要特性，才保证了生理状态下细胞更新以及损伤和疾病时细胞数量的稳定。干细胞已经在多种组织中得以充分认识，如造血系统、皮肤和小肠粘膜嵴。一般而言，干细胞出现于细胞更新代谢旺盛的组织。因此，对于像脑组织这样极少有细胞更新的组织，人们往往想当然地认为，不能在其中找到干细胞。
1992年前，培养神经细胞进行增殖研究仅局限于胚胎组织神经祖细胞。尽管发现了几种祖细胞，没有一种表现为干细胞特性。体内的研究也表明，在生命早期才有增殖现象，成年中枢神经没有分裂活性，损伤喉部能产生新细胞。但是也有例外，如十九世纪六十年代的研究清楚表明，成体脑组织的一个区，即前脑室管膜下，表现有增殖能力。1 但是，当时人们认为这种现象具有种属特异性，并不发生于高级哺乳类动物。
直到二十世纪九十年代，人们才从胚胎和成年脑组织中分离出一群能够接受生长因子刺激的细胞，体外具有干细胞性质。2-4 随后，人们确定了CNS干细胞在成年脑组织中的存在部位，5 并发现这一区域的细胞可以分化为神经元和星形胶质细胞。6 这些研究为神经生物学和利用新生细胞进行组织修复等领域，开辟了新的途径。
如何研究神经干细胞？
像其他组织干细胞研究一样，由于神经干细胞没有大家都能接受的标志，细胞鉴定只能依赖于它们的功能特性。这些体外特征包括：（1）增殖；（2）自我更新；（3）通过祖细胞短暂的扩增，产生大量子代细胞；（4）在一段时间内保持多系分化性能。在体内，这些细胞在疾病或损伤时，必须能产生新的细胞。7 能满足上述所有条件的细胞为干细胞，而部分满足上述条件的细胞为祖细胞。小鼠神经干细胞最早可以在胚胎发育8.5天（E8.5）时的前神经板获得，而大多数试验用E14组织。8 由于从小鼠ES细胞获得的细胞部分具有神经干细胞特性，可以推测，神经干细胞可能从胚胎发育的任一阶段获取。9 胚胎神经干细胞分离培养常用的方法是，将E14特定脑组织微切割，分散细胞并接种于含生长因子（EGF±FGF-b）的无血清培养基中培养。24小时后，神经干细胞（和神经祖细胞）开始增殖，2-3天形成细胞簇。3-5天时，细胞簇增大，多数簇不再贴附于培养瓶底部而成悬浮状态。第7天，克隆性细胞簇（此时称神经球）直径为100-200μm，由大约10，000个细胞组成。此时，即可传代培养。具体步骤是，取出单个神经球，或分散神经球细胞接种于上述培养基中，24小时后神经干/祖细胞开始增长，7天后形成新的神经球又可传代。神经干细胞自我更新和增殖能力，往往使培养细胞总数呈几何式增长。应用上述神经球培养法，细胞可以传代10周，增殖能力无明显下降，使细胞扩增倍数达107。在神经球培养体系中去除生长因子，降低培养血清浓度，并将单个神经球或分散的细胞接种于用基质铺板的培养皿中，数天后，细胞即可分化为中枢神经系统的所有细胞类型：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
利用上述培养体系，可以从胚胎脑几乎所有区域中分离神经干细胞，包括：中隔、皮层、中脑、丘脑和脊髓。在培养条件下，所有区域的细胞表现为共同的特征：高增殖能力，自我更新和向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化。同样，从大鼠和人中枢神经系统中分离的细胞，在无血清培养和生长因子作用下，也能形成神经球，但是，神经球的连续传代能力相当不稳定。
体内能发现神经干细胞吗？
在成年小鼠，神经干细胞主要位于前脑室管膜下层（sub-ventricular zone）和海马齿状回颗粒细胞下层（sub-granular-layer of the dentate gyrus of the hippocampal formation）。定位依据是：将这些区域的细胞取出培养，细胞表现为很强的增殖能力。然而，最近的研究提示，颗粒细胞下层来源的细胞增殖能力有限，海马干细胞位于萎陷的脑室中海马的背侧端。10
虽然神经干细胞与其它干细胞有共同的特性，而对神经干细胞体内作用了解甚少。在室管膜下层的干细胞处于相对静止状态，受照射后可以增殖并重建该区域。5 另外，室管膜下神经干细胞分化的祖细胞，可以在啮齿类动物嗅球中形成新的细胞，并可在生理状态下定居于非人类灵长类动物的皮层。最近的研究也表明，啮齿类动物缺血损伤后，内源性的海马区神经祖细胞增殖并使该区功能得以部分恢复。11
神经干细胞的可塑性
最近几年，有研究指出神经干细胞具有明显的横向分化能力，但是，这些结果并不一致。成体鼠中枢神经系统来源的干细胞移植囊胚后，可以形成鸡或小鼠嵌合胚胎。12 小鼠和人神经干细胞移植给受照射小鼠后，具有造血能力。13 这种横向分化潜能也体现在神经干细胞对肌肉组织的修复作用。14
神经干细胞分离纯化
应用针对细胞表面分子的单克隆抗体，可以识别细胞群体中极少量的造血干/祖细胞，这种分离技术同样适用于神经干细胞。然而，像多数其它组织干细胞一样，神经干细胞也缺乏特异性的表面标记。在最初的研究中，通常使用的抗原分子有CD34、CD45和CD133等。人胚胎中枢神经系统的CD133+5E12+CD34-CD45-CD24-/low细胞群，体外培养时能形成神经球，并可进行传代培养分化为神经元和星形胶质细胞。15 单克隆抗体标记技术同样应用于成年小鼠室管膜区神经干细胞的分离。研究中，作者利用FACS分离nestin+/PNA+/CD24-细胞，神经干细胞纯度达80%，频度提高了100倍。16 最近，人们提出可以根据干细胞排出荧光染料（如Hoechst 33342）的特性，从骨髓、骨骼肌和胎肝等多种组织中分离。这群细胞在流式细胞图像上位于特定的位置，故称为旁群细胞（SP细胞）。SP细胞也存在于原代培养的小鼠中枢神经细胞和传代的神经球细胞。17
总之，与过去的认识相反，在成年哺乳类动物中枢神经细胞特定区域内，有一小群细胞符合干细胞标准，在体内外均表现具有可塑性。神经干细胞的存在，为修复中枢神经系统损伤的细胞替代治疗，开辟了新的治疗途径。目前，首要的任务应是加深神经干细胞细胞和分子生物学特性的了解，建立干预干细胞行为的基因或后基因方法。为达到这一目的，必须建立稳定简易的组织培养系统，以源源不断地提供神经干细胞，并使之标准化，从而推动该领域从实验室进入临床。
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编辑: gaowei2010
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