造血干细胞（Hematopoietic stem cells）
造血干/祖细胞体外检测方法
利用造血细胞体外培养技术，可以检测处于不同分化阶段造血干细胞的增殖分化能力，确定某一群细胞或纯化的细胞群体中HSC的丰度。在体外培养条件 下，HSC具有增殖和分化能力；然而，体外实验更多的是检测造血祖细胞的功能，祖细胞具有有限的自我更新和短期造血重建能力。利用体外培养技术检测到的祖 细胞可以是多向的，能产生多系血细胞，也可以是单向或双向的，产生红细胞、粒细胞、单核/巨噬细胞或血小板。
长期培养
造血细胞长期培养（long-term culture, LTC）常利用预先贴壁的基质细胞作为饲养层，这些基质细胞为造血细胞提供刺激和抑制信号，调节细胞增殖。LTC有多种方法，如利用不同的饲养层细胞（如 原代培养的骨髓成纤维细胞或转化的细胞系）；计数方法也有多种，常用极限稀释法进行频率计算。在长期培养启动细胞（long-term culture-initiating cell，LTC-IC）实验中，收集长期培养的造血细胞成分，并将之接种于含甲基纤维素的半固体培养基中，培养体系中的原始细胞分化，形成造血集落 13。在鹅卵石区形成细胞（cobblestone area-forming cell，CAFC）实验中， 利用相差显微镜可以观察到基质细胞层下存在的造血细胞克隆（鹅卵石区）14。体外培养5-8周后仍具有造血集落形成能力的细胞，就是LTC-IC，被认为 是非常原始的造血细胞。与之相对应，经过短期培养后仍具有集落形成能力的细胞，可能是较为成熟的祖细胞13。LTC-IC和培养5-8周的CAFC具有部 分重叠，两者表型和功能特性相同，但它们的体内重建能力是不对等的13, 14。
人造血干细胞的表型和分离
图1 : Schematic representation of the production of all types of mature blood cells by the proliferation and differentiation of a very small number of HSC.
极少量的HSC通过增殖分化产生所有类型的血细胞。图中也显示了多潜能和系列特异性祖细胞的中间阶段。图中显示常用的鉴定不同阶段造血细胞的表型特征。竞 争性重建单位（CRU）和NOD/SCID小鼠重建细胞（SRC）实验用于鉴定细胞体内造血重建能力。LTC-IC和CAFC所检定的细胞近似，均为非常 原始的祖细胞。高增殖潜能集落形成单位（High Proliferative Potential Colony-Forming Cells，HPP-CFC）和粒-红-巨噬-巨核集落形成单位（CFU-GEMM）为多潜能祖细胞，较系列特异性祖细胞CFU-GM、CFU-G、 CFU-M、CFU-Mk、BFU-E和CFU-E更为原始。可通过形态学、功能特点和系列特异性抗原表达，确定成熟血细胞。更多信息请参阅正文。
集落测定方法
集落形成细胞（colony-forming cell, CFC）培养用于检测某一细胞群体多潜能祖细胞和系列特异性祖细胞，如红系、粒系、单核-巨噬细胞系和巨核细胞系的含量。通常将单细胞悬液接种于至半固体 培养基中，添加多种细胞因子，以促进单个祖细胞增殖分化，形成由数个至数十个子代细胞组成的集落。在光学显微镜下，可根据原位集落内成熟细胞的形态进行分 类计数。在一定的接种细胞数范围内，CFC的数量应和接种细胞数成线性关系。总的来说，在适宜的培养条件下，更原始的造血祖细胞形成两系或三系细胞组成的 集落（混合集落），而偏成熟的祖细胞形成的集落由单一系列细胞组成，前者需要的培养时间更长，以使细胞分化成成熟细胞。
从30年前该方法建立以来，集落培养已经广泛应用于基础和临床研究。CFC是LTC-IC的读出数据，也应用于测定造血干细胞富集和其它体外处理时祖细胞 的含量。此外，CFC培养技术也用于明确造血刺激和抑制因子活性，评估造血移植时骨髓、脐带血和动员的外周血中造血细胞的增殖能力。作为造血细胞功能评估 的实验室金标准，CFC是不同类型造血细胞增殖分化的功能指标，尤其适用于体外处理后造血细胞的功能评价，如去T细胞、造血干/祖细胞富集、基因治疗和细 胞冻存等。与有核细胞总数和CD34阳性细胞数比较，移植物中CFC含量更能精确预测造血植入和总体存活15, 16。
CFC也可作为筛选方法，评价新药或化合物对人或动物造血细胞三系或单系毒性。CFC形成实验提供了一种动物实验替代方法，用于挑选出合适的药物应用于临床试验17, 18。
人造血干细胞的表型与分离
CD34
CD34是人们认识最早的造血细胞分化标志，也是人们在基础或临床研究中用于造血细胞富集最常用的表面分子。正常人的骨髓有核细胞中，约1-5%为 CD34阳性，脐带血中为1%左右，外周血中低于0.1%。在造血干细胞移植过程中，能使清髓受者多系造血重建的细胞，多数都表达CD34。这种观点已经 在灵长类动物19、受亚致死量照射的免疫缺陷小鼠20和胎羊造血移植9中得到证实。当然，大量的临床自体或异体造血细胞移植，也证明了人CD34阳性细胞 的植入能力21，22。CD34阳性细胞包括所有的LTC-IC、多数CFC和淋巴祖细胞，不含有终末分化的成熟血细胞23-26。肿瘤病人化疗、细胞因 子（尤其是G-CSF）或配合其它化合物，可有效地打破造血细胞与微环境之间的相互作用，使CD34阳性和更成熟的CD34阴性细胞，快速动员至外周血。 CD34阳性细胞动员，以及之后的白细胞分离，已经成为临床造血干细胞移植过程中，收获大量造血干细胞的常用技术27。抗体标记和流式细胞术分析，是计数 CD34阳性细胞的最常用方法，用于监测动员效果，从而确定移植必需的最小有效细胞量。然而，必须指出的是，动员的CD34阳性细胞中，真正的造血干细胞 含量不足0.1%，大多数CD34阳性细胞为单系祖细胞，具有有限的增殖能力，移植后不能或只能短期造血。因此，前面讨论的功能实验对评价动员CD34阳 性细胞的造血潜能，是十分重要的。
利用抗CD34单克隆抗体，借助FACS或免疫磁珠（如EasySep?，RoboSep? 或StemSep?）可以分离纯化人CD34阳性细胞。这种分离方法同样适用于灵长类动物和其它动物种类，只是换用动物相关特异性抗CD34抗体而已。
CD34是人造血干/祖细胞的常用标志。然而，也有证据表明，有一群非常原始的CD34阴性HSC，可以植入NOD/SCID 28-30和胎羊31，并在体内外均可产生CD34阳性HSC。目前已知，这群CD34阴性可重建NOD/SCID小鼠造血的细胞，不表达CD38, c-KIT，FLT3和系列特异性抗原，但表达CD133 32,33。与静脉输注比较，通过直接骨髓内注射该细胞，其NOD/SCID小鼠的植入性得以明显改善，提示CD34阴性HSC较难归巢于造血微环境 34。利用胎羊移植模型进行造血连续移植的研究表明，人骨髓和动员的外周血中相当部分造血干细胞为CD34阴性35。然而，利用NOD/SCID小鼠移植 实验发现，人胎肝造血细胞群体中只有CD34+细胞具有再生能力36。因此，人造血细胞CD34表达远比我们以前的认识复杂多变，在揭示已定表型细胞群体 造血能力时，尤应引起大家的注意。
HSC缺乏系特异性标志
原始造血细胞，包括HSC，不表达终末分化血细胞特有的表面标记。这些表面分子称为系列特异性标志（lineage-specific markers, or Lin markers）。利用Lin标记可以区分造血细胞群体中的幼稚和成熟细胞。用于人造血细胞分离的常用Lin标记包括血型糖蛋白A（红系）、T淋巴细胞表 达的CD2，CD3，CD4和CD8、单核/巨噬和粒细胞表达的CD14，CD15，CD16和CD66b、B细胞表达的CD19和CD20、以及NK细 胞表达的CD56等。利用针对这些分子标记的系列抗体，可通过免疫磁珠法（如EasySep?）或密度梯度离心法（如RosetteSep?），富集骨髓 和其它细胞群中的造血干/祖细胞。通常，阴性筛选可使造血干/祖细胞富集20-500倍。影响富集效果的因素包括：所用系列抗原的组合，细胞群的组成以及 细胞筛除效率。在利用FACS筛选原始HSC或其它亚群之前，Lin标记阴性筛选是一种常用的预富集步骤。通过Lin标记细胞，降低了细胞总数，提高了造 血细胞含量，从而可大大节约筛选时间，提高目的细胞的收获量、纯度和活力。必需指出的是，和纯化的CD34阳性细胞群一样，Lin阴性细胞仍是一种异质性 的细胞群。这群细胞中，不足20%具有集落形成能力，更原始的LTC-ICs 和NOD-SCID 植入HSC含量更少，分别不足1%和0.1% 6,13,19,37。
为进一步富集HSC和原始祖细胞，可再增加一些抗体组合。这些抗体针对的抗原，在90%以上的Lin阴性和CD34阳性细胞（包括LTC-IC和CFC） 高表达，而在大多数HSC表面低表达或不表达。这些针对系列祖细胞的标志分子包括：CD38, CD71, HLA-DR和CD45RA 38-42。CD33是一种高表达于成熟髓系细胞的表面分子，早期报道认为HSC和原始祖细胞上不表达43，但近期的研究提示原始祖细胞和 NOD/SCID重建细胞均表达CD3344。因此，清除CD33阳性细胞不是富集原始造血细胞的理想措施。另外，为富集人HSC和原始祖细胞群，可先清 除Lin阴性细胞，之后通过阳性筛选表达造血细胞特异性标记的某一群细胞，如Thy-1 (CD90), c-KIT (CD117) 或CD133阳性细胞等 45,46。
编辑: gaowei2010
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