王水教授：乳腺癌微小转移的研究进展
在西方国家，乳腺癌的发病率位于女性恶性肿瘤之首，约占其中的31%，我国与西方国家一样，女性恶性肿瘤中乳腺癌的死亡率仅次于肺癌位居第二位。95%的乳腺癌患者就诊时，体检、影像学检查等并未发现远处转移，然而，按照目前的认识如肿瘤的分级、肿瘤大小、淋巴结受累情况、雌激素受体检查结果等指标来安排治疗方案，这些病人即使腋窝淋巴结常规病理学检查无转移依据，仍有30%在术后5年内出现复发和转移。这些现象说明，依靠常规的检查方法无法精确判断乳腺癌患者的预后。已有许多文献报道，乳腺癌病人骨髓和外周血中隐存着的肿瘤细胞可作为一个独立的预后指标。乳腺癌细胞是从淋巴管播散至区域淋巴结和通过血管转移至远处，其中淋巴结转移具有重要意义。近年来，通过连续切片、免疫组织化学和等方法检测骨髓、外周血微小转移已经逐渐发展起来，而前哨淋巴结活检（sentinel lymph node biopsy， SLNB）技术的临床应用，使淋巴结微小转移检测精确性进一步提高的同时检测费用明显降低。
一、微小转移的定义
自1869年Ashworth首先在外周血中发现癌细胞以来，人们对肿瘤这一现象的认识不断加深，为了更好地定义常规检查不能发现隐匿存在的微量癌细胞，新的名词不断涌现，如微小转移（micrometastases）、孤立肿瘤细胞（isolated tumor cells，ITC）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）、弥散肿瘤细胞（disseminated tumor cells，DTC）、微小残留病灶（minimal residual disease）、单个肿瘤细胞（individual tumor cell）、隐匿性肿瘤细胞（occult tumor cells）等等，但目前使用较多的是微小转移。
肿瘤细胞从原发病灶扩散到继发部位，并在该处形成继发瘤（转移灶）称之为转移。这一过程包括肿瘤细胞进入淋巴管和血管后，随淋巴流和血流运行，部分具有高度转移潜能的肿瘤细胞亚群与血管内皮黏附并穿过管壁基底膜，然后在远隔部位或器官与宿主组织或细胞相互作用形成继发瘤，非常复杂。由此可见，淋巴系统和血液系统中发现有肿瘤细胞并非一定发生真正意义的转移，ITC和微小转移是不能等同的。
如何定义淋巴结微小转移目前尚有争议。Huvos于1971年提出直径＜2mm的转移灶称为微小转移；以后Fisher将大小修订为＜1.3mm；1980年Black推荐转移灶直径小于受累淋巴结20%为微小转移；国际抗癌联盟于1993年提出转移灶直径在1～2mm之间称为微小转移。文献中定义转移与微小转移的界限在切片上的癌细胞病灶大小从0.2～2.0mm不等，规范癌症分期的美国癌症研究委员会（AJCC）将任何有临床意义的直径＜2.0mm 的肿瘤病灶称为微小转移，目前大多采用这一定义。
二、检测标本
肿瘤细胞从原发灶进入血液系统是发生远处转移的首要条件，尽管这些肿瘤细胞仅有少量能穿过血管并发生转移。骨及骨髓是乳腺癌远处转移最常见的部位，约有80%以上复发转移的病人在疾病发展过程中出现骨转移，临床上常将骨髓微小转移作为乳腺癌可能存在远处转移的重要标志。由于骨髓穿刺有一定创伤，操作比较复杂，病人往往存在较大的顾虑，一般不愿多次接受，因而有学者开始采用对外周血进行检测的方法。
一百年来，腋窝淋巴结是否发生转移一直作为肿瘤分期、判断预后和指导治疗的重要临床指标。然而，常规的病理学检查存在着二种不足：①不能了解每枚淋巴结的整体病理状况；②不能发现淋巴结中存在微小转移，特别是乳腺小叶癌。采用连续切片、免疫组织化学（immunohistrochemistry，IHC）和RT-PCR的方法可以避免出现这一状况，但若对所有腋窝淋巴结都采用以上方法进行检测无疑大大增加病理学工作人员的工作量和检测费用。近年来，SLNB的临床应用有可能改变这一状况。所谓乳腺癌腋窝前哨淋巴结（sentinel lymph node，SLN）是指腋窝淋巴结中最先遭受肿瘤细胞侵犯的第一枚淋巴结，因此可对SLN有的放矢地采用如连续切片、IHC和PCR技术进行检查。
三、检测方法
（一）肿瘤微小转移的检测方法
检测乳腺癌微转移的方法主要有两种，即基于抗体的方法以及基于核酸的的方法。基于抗体的检测方法方法主要有荧光显微镜（fluorescence microscopy，FM），免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）以及流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）等可以分离以及计数单个肿瘤细胞。ICC现在仍然是DTC检测的一个金标准，很多文献中的临床数据都是通过ICC监测得到的，特别是骨髓中。这种方法的优点是可以通过一些关键性的生物标志物，比如HER2，从分子水平上对细胞的特征进行分析，特异性较高。但是，荧光显微镜以及免疫细胞化学等方法都是比较费时费力的方法，使它们难以成为一种常规的诊断方法，而流式细胞术则是一种全自动并且可定量的方法，有着比较高的特异性，比较快的试验速度以及比较好的可重复性和统计可靠性。美国FDA已经批准一种名为CellSearch的检测系统用于对乳腺癌CTC的检测，此检测系统应用上皮细胞粘附分子抗体包被的磁珠捕获CTC，然后用DIAP，CK8，18，19抗体和CD45抗体来检测这些被捕获的细胞，并对这些带有标记物的细胞进行自动化分析计数，具有很高的敏感性。
基于核酸的方法主要包括各类PCR（polymerase chain reaction）技术，无论是定量的或者是非定量的PCR，现在已经广泛用于微小转移的检测，一般来讲PCR技术的敏感性要比基于抗体的检测方法要高，但是它也有一定的局限性，比如易出现假阳性结果，出现假阳性有很多的原因，包括实验技术，引物选择，正常细胞中目标基因的非法表达，存在假基因或者污染等。使用RT-PCR检测微小转移时，必须考虑到敏感性和特异性之间的平衡，一般来讲，敏感性下降就意味着特异性的上升，反之也一样。
（二）骨髓和外周血的检测方法
上世纪50年代，为了检测出循环中的肿瘤细胞，应用了几乎所有的细胞学检测方法，但后来发现，即使是最敏感的方法也达不到1%，价值不大。不久，集落形成实验被采用，其具有肿瘤体外克隆形成能力的特点，但灵敏度只有10－4，且费时费力。到了70年代，免疫细胞化学和免疫组织化学技术的应用，把微小转移的检测水平推向新的高度。而80年代PCR方法的出现，使检测的敏感性又进一步提高。但ICC 和PCR技术诊断肿瘤微小转移都是间接的，由于目前还缺乏敏感性和特异性很高的标志物、缺乏规范和标准等问题，有一定的争议，临床意义还在进一步探索之中。当前检测乳腺癌骨髓和外周血微小转移最常用的方法是ICC和RT-PCR方法。
ICC的检测原理是应用单克隆抗体与相对特异的肿瘤标志物结合，并通过酶和底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在，是目前用于检测乳腺癌骨髓和外周血微小转移最多且较标准的手段。其采用的主要肿瘤标志物有：①肿瘤相关糖蛋白如TAG-12；②上皮细胞膜抗原如EMA、HEA-125等；③细胞角蛋白（cytokeratin, CK），其中CK19特异性较高,使用最广泛。Borgen等采用角蛋白检测257例乳腺癌，阳性率为26.6％，但对照组阳性率也达到5.4％。因此在行ICC时应进行阴性对照和形态学分析。
RT-PCR是检测乳腺癌患者骨髓和外周血微小转移最敏感的方法，敏感性可达10-6～10-7。已证明利用PCR技术在微小转移检测方面较传统组织学方法和免疫组织化学方法更优越，这种方法依赖于特异性靶mRNA的存在。特异性靶mRNA有两种：一种是肿瘤特异性mRNA，一种是组织特异性mRNA。由于目前乳腺癌尚缺乏肿瘤特异性的mRNA，因此现在多采用组织特异性mRNA作为靶基因来检测骨髓和外周血中的肿瘤细胞。
哺乳动物细胞浆中很大一部分是细胞骨架成分，其中包括含肌动蛋白的微丝、含微管蛋白的微管和中间大小的微丝。细胞角蛋白（cytokeratins, CK）是分布于上皮细胞的中间纤维丝，至少包括20个成员，分酸性细胞角蛋白（又称Ⅰ型细胞角蛋白，角蛋白10～20）；碱性细胞角蛋白（即Ⅱ型角蛋白，细胞角蛋白1～9）。CK属于组织特异性mRNA，其作为上皮特异性的标志物在大部分恶性和良性肿瘤组织中存在，而在正常血液和骨髓中不存在，其中CK-19在乳腺癌中特异性最高。Schoenfeld等对78例无远处转移的乳腺癌患者分别采用ICC和RT-PCR技术检测骨髓和外周血中CK-19阳性细胞，结果ICC为25%和5%，RT-PCR则为35%和22%，RT-PCR方法的敏感性明显高于ICC。目前用于RT-PCR检测的肿瘤标志物有：①根据基因改变，如点突变（p53、ras）、缺失（BRCA1、BRCA2）、异构（CD44）、扩增（C-erbB2、EGFR）；②组织特异性标志物Mrna，如cytokeratin、ER、maspin、mucin等；③肿瘤特异性标志物mRNA，如CEA、β-HCG等。Vannucchi等比较了CK-19、maspin、ER和EGFR等四种标志物mRNA敏感性与特异性，认为RT-PCR扩增CK-19mRNA方法是检测乳腺癌微小转移特异性最强。当实验条件或实验技术存在问题以及由于肿瘤分化差异导致某些基因低表达甚至不表达，可出现假阴性；而如果正常组织或造血细胞中某些基因的表达以及假基因的出现，则可能导致假阳性。因此，改进实验条件、选择合适的标志物、正确选择引物、设立正常的对照对防止或减少假阴性、假阳性的出现具有重要意义。近年来，又有敏感性和特异性更高的PCR方法如免疫磁珠分选（IMS）、定量RT-PCR以及采用真时自动PCR仪检测微小转移等的出现，这些必将推动微小转移检测技术的发展和临床研究的进一步深入。
（三）SLN的检测方法
随着SLNB在临床应用越来越广泛，微小转移的检测从ALND术后15～20枚淋巴结到1～2枚SLN，使得病理科医生能集中注意力，更加有效地提高检测效果。他们采用IHC方法，能在低倍镜下排除转移，因为通常HE染色需要在高倍镜下才能观察到淋巴结中很少量的癌细胞而KT染色后低倍镜下即可发现。表3中记录近50年HE和IHC微小转移的检出率。
表3：HE和IHC方法乳腺癌淋巴结微小转移的检出率
与骨髓和外周血检测一样，PCR 方法最为敏感。1994年Schoenfeld等采用CK19 RT-PCR法检测57枚淋巴结，18枚组织学检查为阳性的淋巴结RT-PCR也为阳性，39枚阴性淋巴结中4枚RT-PCR阳性，余下的35例进一步采用Southern杂交，结果又有10例阳性。Schoenfeld等 于1996年又以CK19 mRNA为标记采用RT-PCR方法检测125例组织学检查阴性的淋巴结，结果有20%为阳性。
四、对判断预后的临床意义
（一）骨髓和外周血微小转移对判断预后的临床意义
Braum对4199例乳腺癌病人进行十年随访，共发现有1277例有骨髓微转移（30%），其发生比率随肿瘤大小、淋巴结阳性数目增多而显著增多。10年随访中共有763例病人死亡（18%），骨髓微转移在致死因素中显著超过其他独立因素。在一组未作辅助治疗病例中，骨髓微转移阳性病人死亡率显著高于骨髓微转移阴性病人。一些研究表明，腋淋巴结及骨髓微转移皆阴性者预后较好，腋淋巴结阳性而骨髓微转移阴性乳腺癌病人预后最差。，Diel等发现随着肿瘤增大T1、T2、T3、T4病人骨髓微转移检出率分别为30%、42%、62%、75%。肿瘤分级为Ⅰ、Ⅱ者骨髓微转移为39%，Ⅲ级者为52%。ER阳性、PR阳性病人有较高的骨髓微转移检出率，尽管远处转移率较低。在大多数研究中认为，乳腺癌病人骨髓微转移阳性是一不良的预后指标，并且是对无疾病生存期及总生存期的一个独立预后因素；但也有认为并不能作为一个单独指标，甚至认为该研究无意义。这些结果差异主要是因为实验方法不同及随访时间不同造成。为证实骨髓中检出的癌细胞具有生物学活性，Sharp将乳腺癌病人骨髓中分离出来的癌细胞于体外培养结果可形成克隆，接种裸鼠亦可形成肿瘤。因此，散布在组织中的肿瘤细胞只是转移所需的条件，而形成真正的转移灶尚需其他的生物学条件。我院研究了乳腺癌微转移与EGFR、c-erbB-2、VEGF等基因的高表达有关。另外，肿瘤负荷也是发生转移的重要因素。初步研究提示，乳腺癌微转移中的肿瘤细胞数目决定了将来能否形成转移灶。过去的研究基本上是建立在定性检测上，而随着定量PCR尤其是实时PCR的运用，能更精确地阐明乳腺癌微转移的意义，其方便、准确、快速的特点更具临床价值。我院于1998年曾对68例作骨髓微转移检测者进行随访，随访时间为14~83个月。经多因素回归分析，骨髓微转移与淋巴结状态和临床分期有密切关系。
骨髓微转移检测可能运用于监视期间的治疗效果。一组82例原发乳腺癌病人，治疗初期，检测到有微转移26%，18个月后仅有3%，若淋巴结及微转移均为阴性病人，也许可以不必行进一步的系统治疗。Wiedswang等对356例无病生存的乳腺癌病人，在随访3年时作了第2次骨髓微转移检查，该组病例70%为T1，72%腋淋巴结阴性，于第2次骨髓微转移检查后25.3个月（中位期间）时，其中32例病人出现复发（局部12例，全身20例）。其中骨髓微转移阳性者20.8%（11/53）出现复发，而骨髓微转移阳性者6.9%（21/303）出现复发。提示手术时及3年后骨髓微转移均为阳性者预后不佳。因而骨髓微转移可用于随访，并能及早发现转移病例。
改进实验条件、选择合适的标记物、正确选择引物、设立正常的对照对防止或减少假阴性、假阳性的出现具有重要意义。所以在对乳腺癌微转移的深入研究中，应采用多基因标志物联合检测，应用敏感性、特异性更高的方法，并采用统一的检测方法，扩大样本量进行随访，以进一步阐明乳腺癌微转移的临床意义。
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编辑: muoquan 作者:王 水
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