miRNA qRT-PCR常见问题解答
Q:miRNA qPCR实验的重复如何设置？
A:重复分为两类，一类是生物重复，一类是技术重复，生物重复是从处理样本后重新提取RNA开始，是几次完全独立的实验；技术重复可以在cDNA合成或者PCR反应的两个过程任选一步进行重复，主要看实验操作过程有无问题，一般选择在PCR时重复3次。
Q:5S qRT-PCR的产物有多大？
A:91bp，人、小鼠、大鼠的5S是同源的。
Q:U6 qRT-PCR的产物有多大？
A:94bp，人、小鼠、大鼠的U6是同源的。
Q:Bulge-Loop? miRNA qRT-PCR的产物有多大？
A:80bp左右，不同miRNA的qRT-PCR的产物长度不尽相同，具体长度要依据实际引物长度而定。
Q:NTC 有扩增 ？
A:可能原因：
1) 试剂污染
2) 引物二聚体
解决办法：
1) 更换试剂
2) 降低引物使用浓度
3) 调整程序设置，如提高退火温度，适当增加读板温度
Q:非特异性扩增有杂峰？
A:可能原因：
1) RNA被基因组DNA污染
2) 引物混杂有其他引物
3) 引物二聚体存在
解决办法：
1) 提取更高质量的RNA，并用DNaseI处理样本
2) 在冰上配制反应体系，降低非特异的起始扩增
3) 调整反应体系，如降低引物使用浓度，降低起始模板量
4) 调整程序设置，如提高退火温度，适当增加读板温度
5) 更换被污染的RNA模板、引物、酶等试剂
Q:qPCR产物量少该如何解决？
A:可能的原因：
1) RNA模板质量低或者cDNA模板质量低
2) 靶miRNA基因表达量低或者无表达，无法检测
3) 试剂中存在PCR抑制剂
4) PCR仪是否正常运转
5) PCR程序设置有无问题，如：循环数不够、无读板过程、无制作融解曲线的过程等
6) PCR过程所用试剂少加一种或多种，如，sybr、正反向引物、模板
7) PCR过程所用的酶、sybr等试剂有无失效等问题
8) 定量PCR引物的问题：如使用浓度太低、引物设计不好、引物合成序列有误等
解决办法：
1) 建议在试验中加入阳性对照RNA
2) 增加RNA和/或cDNA模板的量
3) 保证定量PCR仪运转正常
4) 调整程序设置，如增加循环次数，正常读板过程和溶解曲线制作过程
5) PCR反应所使用的酶一般为热启动聚合酶，预热过程需根据酶说明书设置
6) 保证PCR反应体系配制过程中无少加或漏加试剂，并且试剂均有效
7) 第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10
Q:cDNA产量低该如何解决？
A:可能的原因：
1) RNA模板质量低
2) 对mRNA浓度估计过高或浓度未测准确
3) 反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
4) 反应体系少加试剂
5) 控温过程不正确，高温使反转录酶失效，低温达不到反转录酶的最佳反应效率
6) 反应体积过大，导致试剂被稀释
解决办法：
1) 重新提取高质量的RNA模板，并准确测定其浓度
2) 保证加入各种试剂建立完整的反应体系
3) 保证控温过程正确
4) 反转录反应体系不要超过50uL
Q:扩增曲线先正常上升，后来却下降，溶解曲线不规则，原因何在？
A:反应体系中存在酶抑制剂或者其他原因导致PCR酶失活或者染料降解，建议重提RNA模板，更换PCR试剂重新实验。
Q:转染了mimics或inhibitor后，可否用qPCR引物检测转染后miRNA量的变化，注意的问题有哪些？
A:我们的实验发现，对于转染效率比较高的细胞（如hela，A549等） ，一般转染mimics 50nM后与no-target相比高出约1万倍，转染表达miRNA的质粒后与空白对照质粒相比高出几百倍，inhibitor理论上与miRNA结合后阻止其与靶mRNA的结合，inhibitor并未导致miRNA的降解，因此qPCR可以检测mimics转染后miRNA表达的上升，无法检测inhibitor转染后miRNA表达的下降，当然如果某些inhibitor确实通过未知途径导致miRNA的降解也可检测到miRNA表达的下降。
RNA提取及RT-PCR过程无特殊注意事项，只是转染过程注意保证转染效率。
Q:内参与miRNA的反转录反应应该分管进行还是同一管进行？原因何在？
A:内参的设置主要是为了校正上样量的差异，保证基因在同一起跑线上比较。如果能保证加样量一致，两种方法没有实质区别。一般基因mRNA检测时一个反转录就可以检测所有mRNA基因，因此反转录是在同一管进行。由于miRNA自身短小的特点，每个miRNA均需用特异的反转录引物进行反转录，这些反转录引物如果不能混在一起，则内参的反转录也分开进行。
Q:不同的miRNA反转录引物可以混合使用吗？
A:引物之间的混合有可能导致引物二聚体的产生及非特异的扩增，因此引物混合前要做预实验比较混合前后对miRNA定量检测的影响，如果证明混合后没有影响才能混合使用，建议每个miRNA还是分开反转录和定量PCR。
Q:不同miRNA的溶解曲线峰值有差异，同一miRNA引物扩增不同RNA模板的溶解曲线峰值有差异？
A:溶解曲线只有用染料做检测时才有，用Taqman探针等则无溶解曲线绘制过程。溶解曲线的绘制原理是内嵌染料结合在体系中所有双链DNA上（dsDNA），包括目标产物、非特异扩增产物、引物二聚体等，随着温度从低于产物溶解点缓慢上升到高于产物溶解点，产物逐渐解链，内嵌染料释出，实时仪器连续监测样本的荧光值逐渐降低，并在产物溶解点处荧光值下降最快，反应在溶解曲线上就是一个峰值；产物完全解链后，仪器监测的荧光值达到平台期。扩增产物的长度、G/C含量、pH值、离子浓度、蛋白残留物等均会影响峰值。对于同一引物扩增不同模板，一般认为峰值相差±1℃时可以忽略不计，否则考虑引物、模板等有问题，需更新重做实验。对于不同引物，若为单峰，则不必考虑峰值差别的影响。
Q:实验所用的酶和其他试剂是否有特殊要求？
A:引物对于酶、其他试剂、仪器等没有特殊的要求，唯一的要求是在相同的条件下进行实验，如用相同的仪器，相同的试剂，相同的程序等。不同厂家的试剂、同一厂家不同批次的试剂、不同的仪器等做出来的结果在扩增曲线，及溶解曲线可能会稍有差异，但这对于相对定量没有影响。
对于不同厂家的试剂或者不同的仪器，建议做一个预实验先摸索我们推荐的反应体系及程序是否可用，如果结果不理想，可根据试剂说明、仪器参数设置原则等做适当调整。
Q:PCR扩增效率低？
A:理论上说，PCR扩增效率接近100％是最理想的扩增效率，但实际操作时，反应的扩增效率应该在90％－110％之间，扩增效率的计算公式为：扩增效率E=10-1/斜率-1，其中斜率为标准曲线的斜率，其范围应该在：-3.1至-3.5。如果扩增效率低，可能的原因是PCR反应中存在PCR酶抑制剂、PCR染料失效、引物设计不当、反应条件未优化等；扩增效率大于100％时，可能的原因是系列稀释样品时的计算或者加样错误、有非特异扩增产物、或者有引物二聚体产生等。
Q:PCR过程设置的对照及反应的问题？
A:阳性对照：一般用RNA反转录的cDNA做模板，检测看家基因，如β-Actin、GAPDH等。目的是检测反转录及PCR过程中反应体系配置、仪器等参数的设置及操作过程有无问题。或者用用质粒做模板，定量PCR定量扩增克隆产物，检测PCR反应体系及操作过程的有无问题。
阴性对照：用水做做模板阴性对照，检测反应体系所用试剂有无污染。用RNA做模板阴性对照，检测抽提RNA过程有无DNA污染。
内参检测：可检测β-Actin、GAPDH等看家基因的表达，以作内参。
Q:对于Bulge-Loop? qRT-PCR Primer中RT反应有没有特殊要求？
A:并无特殊要求，普通的试剂盒即可进行RT反应，实验时将试剂盒的RT primer 换成Bulge-Loop? RT primer即可。具体的实验信息参阅所使用的RT试剂的操作说明。
编辑: gaowei2010
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