miRNA qRT-PCR 表达检测
miRNA表达分析是生物功能研究的基础，是当今生物学研究的热点领域。准确检测细胞或实验动物组织中miRNA的表达可用来帮助研究者更快地切入miRNA的功能研究；而准确检测病理组织或血液中miRNA的表达谱则有助于分析miRNA与疾病的相关性，这为探索miRNA作为疾病诊断及治疗的生物标志物，和为开发以miRNA为基础的药物奠定了基础。锐博生物经过不断的探索与努力，完成了针对miRBase数据库中全部人、小鼠、大鼠miRNA的 Bulge-Loop? miRNA qPCR Primer Set开发工作，并在细胞、组织或血液中miRNA表达谱的检测中得到了非常可靠的结果。锐博生物现向您提供最优质的miRNA实时荧光定量PCR全套技术服务。
Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR是锐博生物自主开发的成熟miRNA检测方法，采用SYBR Green染料，不需荧光探针，具有高灵敏度和特异性的优点。该检测方法包括两个步骤：（1） 基于茎凸环结构引物的逆转录反应。（2） 实时荧光定量PCR。茎凸环结构的逆转录引物与miRNA 3'端部分结合，在逆转录酶作用下进行逆转录反应，特异的正向引物、通用反向引物及SYBR Green荧光染料进行定量扩增，实现逆转录产物实时定量检测。
图1 Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR原理示意图
■ 特异性--hsa-let-7家族成员同源性极高（上表），彼此之间仅单个或数个碱基的差异。传统检测方法对此无能为力，无法区分各个家族成员。但Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR方法采用了具有茎凸环结构的逆转录引物以及高特异的miRNA正向引物，保证了该方法的特异性，高度同源的miRNA也能被准确检测。
■ 灵敏度--能够准确定量0.1pg总RNA中，最低量至5个拷贝目标miRNA， 具有7个数量级的动态变化范围。比传统的miRNA定量检测方法（如Northern blot和micro-array）具有更宽广动态变化范围，无需担心因样品量少或者miRNA表达量低而无法精确检测。
■ 准确性--Bulge-LoopTM miRNA实时定量PCR可验证微阵列芯片表达谱数据的准确性。尽管只有少量的样品， 该方法也可有效、准确、可重现地检测出miRNA的表达量。
Bulge-LoopTM miRNA qPCR Primer Set是一个包含了miRNA特异的逆转录引物，以及PCR正反向引物的套装。具有茎凸环结构状的miRNA特异逆转录引物以及高度特异的正反向引物，使得Bulge-LoopTM miRNA qPCR反应避免了miRNA前体的干扰。并且Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR反应的模板可以是总RNA，也可以使已纯化的miRNA分离物。通常细胞或组织样本采用U6 snRNA或5S rRNA作为miRNA检测的内参，适用于单个或多个样品中不同miRNA的相对定量；样本中miRNA的绝对数量，可使用化学合成的miRNA标准品（MQP-0412）来制作标准曲线。
1、Bulge-LoopTM miRNA qPCR技术服务项目：
a) 相对定量：以U6 snRNA或5S rRNA为内参，检测样本中相关miRNA的表达量；
b) 绝对定量：以化学合成的miRNA成熟链（MQP-0412）为标准品，做5个梯度点以上的稀释后制作定量标准曲线，通过标准曲线对待检测miRNA进行绝对定量；
c) miRNA芯片数据确认：对芯片所筛选目的miRNA进行qRT-PCR数据验证。
2、Bulge-LoopTM miRNA qPCR技术服务方法及仪器：
用SYBR Green I荧光定量PCR试剂检测；
检测仪器为Bio-Rad CFX96，ABI7300等。
3、Bulge-LoopTM miRNA qPCR技术服务流程：
a) 样品RNA准备
b) RNA质量检测
c) 逆转录合成cDNA
d) 实时荧光定量PCR
e) 分析结果、提供实验报告
编辑: gaowei2010
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