RNA 提取策略及RT－PCR技术

2013-03-02

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第一部分RNA 提取策略

1、 RNA降解的原因内源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因为人体细胞自身就是几十分钟（20min？）mRNA被降解一轮，所以不管是组织还是细胞还是液体状样本在离开其中细胞的最佳生活状态后都应该尽快的被妥善的方法保存起来。外源性RNA酶也是一个需要注意的因素，最常见的就是毛发尤其头发，灰尘，唾液，塑料手套这四个兄弟。针对它们我们应该戴帽子，口罩，橡胶无菌手套，在清洁灰尘少的地方提取RNA。我上面说了内源性RNAase污染才是关键，所以有些同志没有注意这些对外源性RNAase的防护RNA也提取的很出色。但是如果你运气不太好的话外源性RNAase污染影响很大的。

2、样品的取材我们抽提RNA往往都是需要其mRNA，而mRNA的表达量和细胞或者组织的生长状态息息相关，我们取组织块应该避免取到坏死组织，而细胞我们应该在其处于生长旺盛的时期收集（贴壁细胞消化要迅速，离心要稍为快些，甚至可以不消化下来直接进入裂解步骤；此外还可以采取先震荡敲击培养瓶的方法使细胞和培养瓶的结合下降，然后用吸管吹打培养基地方法把细胞吹打下来，这样细胞的代谢不会明显的受到抑制。注意在平时传代的时候就要注意观察细胞除了用胰酶消化下来以外是否还有其他比较简单的方法）（此外还可以把培养液倒掉后迅速的加入裂解试剂开始抽提ＲＮＡ）。

3、待提取样品保存方法这些保存方法温度从4度到零下196度不等，选择哪一种保存方法关键是要对这些保存方法的优缺点有清醒的认识。根据你需要的RNA种类可以做简单的分类。包括RNA病毒 RNA ，mRNA（各种），rRNA等其中最容易降解或者破坏的就是mRNA，最不容易损失的就是RNA病毒RNA（因为有蛋白壳保护）。超低温保存：特指液氮保存不管组织还是细胞如果需要其中的mRNA必须在液氮中保存，-70度等方法都是错误的方法，在很短的时间内或许可以，但是长期是不可能的。 -20~~~-70摄氏度保存： RNA病毒的RNA可以在这个温度段安全的保存。但是其产生的mRNA还是必须超低温保存。

4度保存：有特殊的保护试剂存在地情况下组织的保存：应该是离体后在1min内就放入液氮或者保护试剂中。由于提取RNA对组织块有一定量的要求，大约100mg居多（脂肪细胞需要的量多的多，因为细胞是大大膨胀的），所以在取材前就需要明确到底你需要的组织大概多大是100mg，令少勿多。如果是取临床的标本，就应该带上液氮罐子，DEPC处理的器械，锡箔纸，线等在手术室外等候，标本一切下就尽快进行切割（大概100mg一块），包装（锡箔纸内），捆扎（方便在液氮罐子中寻找），迅速丢入液氮罐子中，最好是1min内完成（所以大家取材前一定要好好联系一下，不要到时候手忙脚乱的^_^）细胞的保存：比较麻烦些，所以大多都是直接提取RNA再保存。建议离心收集后用特殊保护试剂重悬后保存。

4、RNA提取提取RNA可以分为总 RNA，mRNA，Virus RNA（RNA病毒）几类Trizol即异硫氰酸胍-苯酚法，这种方法的原理是：首先用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和水相，从而使DNA和RNA分离开来。进一步通过有机溶剂来抽提沉淀RNA，就可以得到纯净的RNA；

Trizol最早是MRC实验室的科学家发明的方法，后来把专利卖给了 invitrogen/Gibco，invitrogen/Gibco将此方法推广到世界。他的trizol曾经由其他公司OEM制作，现在已经自己生产。本来Trizol是一个专利的品牌，但是国内也有不少仿制的品牌，基本的原理是一样，配方稍有不同。RNeasy kit： Qiagen的王牌产品，号称适用于各种RNA抽提，其实在特殊的组织比如大脑，肌肉，脂肪组织还是选择特殊抽提试剂为佳。此外细菌RNA抽提也最好使用专用抽提试剂盒。这些产品Qiagen都提供。注意凡是Qiagen的试剂盒抽提应该是没有5S带的，因为它将5S破坏掉了。其他的比如 roche，promega等都很好的是的。尤其promega性价比最高！

注意各种方法对于组织都需要先碾磨，应该用陶瓷碾磨器，同时一定要在碾磨同时不断的加入液氮。（少数牛人号称从来不加液氮也提取的很好，我只能说他运气实在不错）。

特殊的RNA抽提试剂盒---mRNA抽提试剂盒：单纯的抽提mRNA的试剂盒很少见到有人在使用，但是其具有一般RNA抽提试剂盒没有的优点，在一些实验中有出奇致胜的效果，推荐promega的总 RNA提取KIT，效果与Qiagen差不多，价格便宜多了，性价比最高的好东东！

试剂盒提取的其优点有以下几点：

1、提取得mRNA纯度高，因为对于很多实验rRNA其实也是一种污染，我们只想RT我们需要的mRNA，但是如果用特异性引物或者随机引物就会连rRNA 一起RT，造成大量的我们不需要的cDNA出现。

2、鉴定时观察是否有严重的DNA污染时非常方便。mRNA抽提后电泳只是看到淡淡的一条短拖影带，此时如果有DNA污染可以很容易发现，因为背景很浅。

3、RNA的鉴定RNA抽提出来之后，首先做的工作是分装保存，然后取其中一管用于鉴定。鉴定方法如下：对RNA的鉴定包括几个方面，第一是数量的鉴定，第二是质量的鉴定，重点是质量的鉴定。

一般的琼脂糖凝胶电泳，注意不要用甲醛变性电泳（又不是做northern，实在没有必要）。电泳槽注意一定不要用DEPC处理，一定要保证电泳体系中有少量的RNAase存在。分别在加样孔中加入1，2，3μlRNA抽提溶液。在旁边加入DNA marker。1%琼脂糖凝胶，10V/cm的电压，电泳10min成像一次，看电泳情况，如果28s和18s还没拉开，继续电泳10min成像，如果任没有拉开再次电泳5min。如果还没有分开多半28s已经遭到破坏，不可能看到典型的3条带了。

好的RNA的特征：

A、RNA应该呈现出3条rRNA带。分别是5，18，28SrRNA的带。5s最好是要可见，除非抽提步骤中故意将其破坏

B、28s亮度是18s亮度的一倍，其他比例关系均提示RNA有一定程度的破坏。

C、不能有多的带出现。出现多的带有两个可能，一是DNA污染带，二是rRNA破坏断裂带。D、rRNA之间可以看到很淡的，雾蒙蒙的mRNA拖带。E、琼脂糖凝胶被RNAase处理后电泳带基本消失，没有明显的，边缘清晰的带残留（不用说这些就是明显的DAN污染，而且是很大量的DNA污染）

如何用RNAase处理凝胶呢，为何要处理?? DNA是不会被RNAase破坏的，所以我们发现凝胶有可疑的带需要鉴定其到底是RNA还是DNA，如果是DNA就有比较大的问题了，如果是RNA到不用过份担心，因为只是提示有rRNA断裂而已。我们可以在RNA电泳完成后，把胶用薄膜手套包好（RNase的良好来源），放置5－10h后再次成像。如果前面起初的带减弱并模糊了说明是RNA被降解，如果出现某个带或者拖影一直不见模糊，那么DNA污染的可能性就大了（由于RNA被降解，有时胶放置一阵后反而更清晰了。）注意RNA电泳加DNA marker是很有必要的（虽然很多白痴说不需要，那是因为没有意识到具体DNA marker的作用）。DNA marker加进去后，一来可以指示RNA电泳中可疑带的位置，方便和在胶被放置后成像的结果进行比较。注意比如28S在某个位置，有时候，胶被放置后 28S降解带会前后移动，不一定就在最初的位置形成一团降解后图象。其次DNA marker有显示琼脂糖凝胶的功能状态的作用。EB等染色剂会挥发造成成像没有结果，DNA在胶中也会轻微弥散，此时如果胶放置后发现上面空空的，没有带出现，不要太高兴，不一定就是RNA在胶上降解完全了。事实上有可能是EB挥发引起胶不显色的结果，尤其有些人把胶一直泡在buffer中的情况。此外发现带型开始模糊也不一定就是RNA降解的结果，也可能是核酸都在弥散开。所以DNA marker是非常重要的。

第二部分RT-PCR

一、一步法RT-PCR试剂盒子选择指南

RT-PCR试剂盒最好的有Qiagen，Invitrogen，Stratagene三个品牌。但是价格都比较昂贵，不是首选。其中Promega是国内的首选，质量很好，价格合理，性价比最高的，投入和产出比最让人放心的产品。

Promega Access RT PCR试剂盒介绍：使用的是1.AMV Reverse Transcriptase（成功的RT必须考虑消除RNA中的多数次级结构。为次，合成cDNA的第1条链最好在较高的温度下进行。MmlV反转录酶能采用的最高温度是42摄氏度左右，AMV的活力在Access RT-PCR系统中可以达到48摄氏度（但是实际上大多都是45摄氏度完成RT）。因此，使用AMV反转录酶，可以消除RNA次级结构的负面影响）2.Tfl DNA Polymerase 这个是promega比较出名的Taq酶，性价比虽然不如takara，但是也不失为一种PCR利器。3.mRNA模板的量在1-100ng的范围内注意是mRNA的量哟。建议加1μg总RNA。4.不能用氯化镁代替硫酸镁。Tf1DNA聚合酶在用硫酸镁和AMV/Tf15X反应液时活力有很大提高。 5.AccessQuick? RT-PCR System 就是预装的Acess RT PCR system，由于镁离子已经加到反应体系中，所以使用自主性稍为受限，但是更方便些，适合不太难的RT过程。价格稍为便宜些。

性价比比较高，推荐品种。Takara one step RNA PCR kit 使用的是1.AMV everse Transcriptase 可惜takara在酶制作方面主要强在PCR酶类，其他酶的制备不是很强。这也是该试剂盒不如promega的原因。2.AMV－optimized Taq Takara的PCR酶制作功力实在不错。3.总RNA少于1μg 建议不要少加，因为该试剂盒的RT能力实在不让人彻底放心。但是多加模板会造成DNA模板污染加重。价格比较低廉，性价比个人认为不及Promega试剂盒。Takara mRNA selective PCR kit 运用了特殊的机理来选择性的扩增cDNA。似乎说是mRNA selective是不对的，其他RNA也是可以扩增的，关键是RT的选择啊。增污染DNA模板的。本来这个技术理论上是非常诱人的，可是考虑 takara的功力还是劝大家慎用。

成功的RT PCR的要素

1、高质量RNA 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般不必使用oligo（dT）选择性分离poly（A）+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly（A）+ RNA，都可以检测到扩增结果。另外，分离poly（A）+ RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。但是我个人认为不会，除非mRNA抽提试剂盒或者相关方法对内参以及目的基因的mRNA有选择性，否则样本间抽提效率的差别完全可以用内参来校正。然而，当分析稀有mRNA时，poly（A）+ RNA会增加检测的灵敏度。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10，000×g离心5分钟。也可以使用Qiagen等公司的特殊RNA保护试剂。 Merck的inhibitor是世界第一，大家可以选择性使用。在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的 RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。

2、使用无 RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-mlV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源 RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA 链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的 RNaseH活性将会大有裨益。而且降低逆转录酶的RNaseH活性会加大RT酶的热稳定性。通常有点突变和缺失突变两种，优先选择缺失突变的。此外 AMV酶热稳定性更高，推荐。

3、提高逆转录保温温度较高的温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物（三种引物都可以的）在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。这个方法可以试一试。但是这个步骤之后反应条件如何设置我没有经验，是加入酶和其他反应组分后变性再RT还是直接开始RT程序？我认为后者才对。此外是否可以考虑加入RNA inhibitor更为安全一些。还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。上面简单的处理方法倒是不花钱，呵呵。对这些困难模板的扩增可以使用一些特殊的逆转录酶，逆转录反应可以置于较高温度下进行，增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。此外注意不要在高于60℃时使用oligo（dT）和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。此外RNA在高于65℃时开始水解，对于 ≤1kb的RNA第一链合成温度可以为70℃，对于＞1kb的RNA则需要＜65℃。

4、使用逆转录反应的增强剂包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影响SuperScript Ⅱ或MmlV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。为了在逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10%的甘油并在 45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4%，这不足以抑制PCR。5、RNaseH处理在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅡRNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。通常是不推荐此方法的。

三种RT引物的选择

Oligo dT 要求RNA必须有Poly A，所以真核生物的mRNA适用。他主要适合长链甚至全长mRNA的RT，这样对RNA样品的质量要求较高，最好不要有明显的DNA污染，RNA降解和 RNA断裂（如电泳中出现多条非典型的带而又明确不是DNA带那么就要考虑RNA出现断裂的情况）其RT通常有标准浓度，比较好掌握。随机引物适合各种 RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低），关于是否对具有复杂二级结构的模板有特殊的优点只能说maybe，事实上很多情况下我们是没有分析RNA的二级结构的。（我用RNAstructure分析，但是一般分析发现复杂二级结构不是想到换用随机引物，而是考虑做巢式 PCR或者考虑做二步PCR，因为引物设计处有连续复杂的二级结构设计引物就会设计不出来，但是如果引物退火处后面不远就出现连续复杂的二级结构那么不用二级结构分析软件是不容易发现的而且它也会严重影响PCR扩增）事实上引物退火后面不远处如何出现严重连续二级结构是我们需要注意的，改用随机引物做RT 倒是是比较好的选择，但是如果不在PCR阶段针对性的修改策略是不行的。特异性引物注意只能用你设计引物时的下游引物做RT，自己画图就明白了。适合各种 RNA的RT，适合序列肯定的模板，常用于一步法RT－PCR。但是引物设计质量影响RT的结果，而且不同引物退火温度本来就不相同，所以按照说明书按照一个温度做不是最佳选择，这样对操作者的技战术水平提出了严峻挑战。所以通常适用于引物设计和合成有保障，引物退火处之后没有复杂二级结构，目的模板丰度高（注意丰度高是指的目的gene的mRNA丰度高，与总RAN是两个概念）的情况。通常不推荐。有些试剂核诸如Qiagen的RT试剂盒很讨厌不带随机引物和Oligo dT，这时可以先用特异性引物试一试，看看情况再说，做不出来也不要紧，这不是RT的最佳选择，只是不用多花钱的妥协选择而已^_^。至于其合成的 cDNA更为特异从而以后PCR更为特异的说法虽然有一定的道理，但是纯属于理论性质的，不能作为选择他的原因。通常加入某个引物（模板其实没有这个序列）RT，然后用这个引物扩增还是可以得到很多非特异扩增产物的，只是片断一般不超过400bp。所以使用特异性引物特异性更高的说法不能全信，尤其是扩增片断比较短的时候（小于400bp）。因为很少有RT酶可以在退火温度反应而不失活的。除非少数耐热的很贵的RT酶。