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基因敲除/基因敲入小鼠技术服务
服务描述：
赛 业生物科技提供以下三种类型的基因打靶小鼠制备技术服务：基因敲除小鼠，条件性基因敲除小鼠，基因敲入小鼠。大体的技术服务流程包括以下四部分：打靶载体 设计与构建，打靶成功的ES细胞筛选，由打靶ES细胞囊胚注射得到嵌合体小鼠，由嵌合体小鼠繁殖出生殖遗传系基因打靶小鼠。
服务周期：
- 打靶载体设计与构建 8周
- 打靶成功的ES细胞筛选 3周
- 由打靶ES细胞囊胚注射得到4周龄嵌合体小鼠 15周
- 由嵌合体小鼠繁殖出4周龄生殖遗传系基因打靶小鼠 15周
服务承诺：
对于协议最终要求的成果是嵌合体小鼠的客户，赛业生物科技承诺提供不少于2只嵌合率大于50%的嵌合体雄性小鼠。
标准品系：
ES细胞品系：E14Tg2a (129背景)；
JM8(C57BL/6N品系)；
JM8A3(C57BL/6N 品系，Agouti毛色)
注射用囊胚品系：C57BL/6×C57BL/6
服务流程
1、打靶载体设计与构建
项目开始后，根据客户项目的具体情况和要求赛业生物科技的技术人员将在一周内按客户的实验需求提供打靶载体设计方案。经客户确认设计方案后，赛业生物科技开始构建打靶载体。以下是打靶载体及成功打靶后染色体基因结构的示意图：
Fig a. Loss-of-function allele
Fig b. Conditional knockout allele
2、打靶成功的ES细胞筛选
打 靶载体测序验证正确后，线性化载体，然后电转入ES细胞，通过载体上的正负筛选基因获得阳性的ES克隆。挑取这些阳性抗性的克隆，并扩大培养至三份，一份 冻存保留，一份正常培养， 一份用于基因组DNA提取。选取PCR鉴定打靶载体正确插入的ES基因组DNA用于Southern Blot鉴定，将Southern Blot鉴定的ES扩大培养并液氮保存。
3、由打靶ES囊胚注射得到嵌合体小鼠
扩 增经鉴定插入或置换片段位置正确的打靶ES克隆，以囊胚显微注射的方式将一定数量的打靶ES细胞注入C57BL/6×C57BL/6小鼠囊胚中，然后将囊 胚移植到假孕的小鼠子宫中。通过小鼠的毛色中来源于ES细胞毛色的比例判断嵌合程度的高低，以及该小鼠的后代中可能获得生殖系传递能力。
4、由嵌合体小鼠繁殖出生殖遗传系基因打靶小鼠
将嵌合体小鼠与适当品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，通过PCR方式检测小鼠是否含有打靶序列。如有，则该小鼠为具备生殖遗传能力的打靶小鼠。
5、嵌合体小鼠生殖系传递鉴定
将嵌合体小鼠和适当品系野生型小鼠交配，通过后代小鼠毛色或PCR基因型鉴定的方法验证嵌合体小鼠生殖系传递能力。
服务的流程示意图：
编辑: nina06
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