dxy

四、免疫胶体金的应用

1、胶体金在光镜水平、电镜水平的应用

直径为3～15 nm胶体金均可用作电镜水平的标记物。最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒进行双重或多重标记。

胶体金用于光镜水平、电镜水平的研究，主要包括：①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养中细胞内抗原的检测。③组织切片中抗原的检测。

2、胶体金在流式细胞仪中的应用

应用胶体金标记的抗体，分析细胞表面抗原。胶体金可以明显地改变红激光散射角，区分不同的标记，能同时进行几种标记。

3、凝集试验

单分散的免疫金溶胶清澈透明。与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒增大、沉降，光散射随之发生变化，溶液的颜色发生变化。

4、免疫印迹技术

用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，与特异性的抗体保温后，再与胶体金标记物温育，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。金免疫印迹技术有相当高的灵敏度。采用免疫金银染色法，灵敏度可低至0.1 ng。

5、胶体金在肉眼水平的应用--胶体金免疫结合试验

根据检测装置的不同可分为金免疫层析试验和金免疫渗滤试验。

1、金免疫层析试验

（1）免疫层析条的组成，有4个组分：⑴吸水纸（加样区）。⑵玻璃纤维膜，膜上吸附着干燥的金标抗体（流动带）。⑶硝酸纤维素膜，膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应的质控物条带（检测带）。⑷吸水纸。以上各组分首尾互相衔接。

（2）免疫层析条制作中须注意的几个问题

微孔滤膜：硝酸纤维素膜有2个特性：较高的蛋白吸附容量和良好的亲水性，应用最多。硝酸纤维素膜的活化：先使硝酸纤维素膜上形成氨基手臂，然后再加入戊二醛在手臂上形成自由醛基，多肽与活化膜的活性基团共价联接。

受体：①与膜材料的结合稳定。②有较高的生物活性，因而有足够的配体捕获容量。③有较高的纯度，以保证检测的特异性。④可流动性。标记或非标记受体以干态吸附于流动带，在流动带加入高效助溶剂，从而使受体具有快速溶解的特性。

（3）反应模式有夹心法、间接法、竞争法

例1 金免疫层析法检测吗啡（竞争法）：

吗啡是鸦片类镇痛药，抑制中枢神经系统。是可待因和海洛因的主要代谢物质，吗啡不经代谢即可排泄。

测定原理：吗啡偶联物和胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体固定于膜上测试区。通过吗啡偶联物和尿液中的吗啡竞争结合金标单克隆抗体，最小检出量300 ng/ml。

结果判定：

阳性（+）：吗啡300 ng/ml以上，质控区出现一条紫红色条带，测试区内不出现紫红色条带。吗啡浓度高于300 ng/ml时，胶体金抗体与吗啡全部结合，从而不与吗啡偶联物结合而不出现紫红色条带。阴性（-）：吗啡在300ng/ml以下。出现两条紫红色条带，一条在测试区内，另一条在质控区内。吗啡浓度低于300ng/ml时，胶体金抗体不能与吗啡全部结合。这样，胶体金抗体在层析过程中会被固定在膜上的吗啡偶联物结合，测试区内会出现一条紫红色条带。无效：质控区未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。

质控区 测试区 流动带

二抗 吗啡偶联物 金标单抗

例2 金层析免疫法测定甲胎蛋白（夹心法）：

甲胎蛋白（AFP）是原发性肝癌的肿瘤标示物，对肝癌的早期诊断、早期治疗具有重要临床意义。AFP单抗A、B，羊抗鼠二抗固定于硝酸纤维素膜上，金标AFP单抗C固定于玻璃纤维素膜上。阴性1条带，阳性2条带， 3条带为强阳性，不出现有色条带为试剂失效。

质控带 阳性 阳性 流动带

羊抗鼠二抗 单抗A 单抗B 金标单抗C

例3 金免疫层析法检测梅毒抗体（间接法）：

胶体金标记的抗人IgG，样品中的梅毒抗体与胶体金标记的抗人IgG结合，沿硝酸纤维素膜移动，在包被有基因重组的梅毒螺旋体抗原结合，出现红色反应线。

质控带 阳性 流动带

抗原 金标抗人IgG