耳蜗半薄切片在形态学研究中的应用
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材料与方法
一、材料
1.选用SD大鼠耳蜗氨基糖甙类抗生素损伤模型
2.取材：
氯胺酮肌注麻醉迅速断头取出内耳，细针挑破蜗尖，去除镫骨足板，置入4%多聚甲醛液中4℃固定24 小时，更换10%EDTA 液三天一次，脱钙两周。
3.后固定：选用上述脱钙后的耳蜗，在解剖显微镜下修小耳蜗标本（修去前庭部份，注意修剪出极性，勿修成正方形与圆形造成包埋困难）后，用0.01M 的PBS缓冲液漂洗，在1%锇酸中固定1.5 小时，然后再用0.01M 的PBS 缓冲液漂洗。
4.脱水：
梯度酒精：30%、50%各30 分钟，70%过夜，90%20 分钟。再经丙酮脱水：90%酒精+90%丙酮（1:1）20 分钟，90%丙酮20 分钟，100%丙酮20 分钟×3 次。以上脱水过程中，除100%丙酮脱水时于常温下外，其余各步均于4℃冰箱内进行。
5.浸透剂浸透：
纯丙酮+618 包埋液 2：1 室温 3～4h
纯丙酮+618 包埋液 1：2 室温 过夜
618 纯包埋液 37℃ 2～3h
6.平板定向包埋：在解剖镜下，蜗尖朝上，蜗轴与切片平面平行，埋入包埋槽，不建议使用胶囊包埋，定位比较困难。
7.固化：
37℃烘箱内 过夜
45℃烘箱内 12h
60℃烘箱内 24h
二、方法：
包埋后的同一标本进行两步研究，先行半薄切片光镜研究，再做常规透射电镜研究。
1.半薄切片光镜研究：
（1）制片
将环氧树脂包埋块用标本夹夹持，置解剖显微镜下，用锉刀与安全刀片修磨去掉样品周围的树脂，与常规电镜定位不同，仅修去多余树脂，尽量保留样品的最大面积，以便更多地保存标本材料中的信息，亦无需切出定位角。磨至中轴将近，于超薄切片机上用新制玻璃刀（勿用已超切标本的）切出厚度为1µm 的过中轴连续切片，捞片后置于载玻片蒸馏水滴上，在60℃恒温加热板上展片并烘干，切片便牢固地贴附于载玻片上（如不用买来后再次清洗过的玻片，1µm 以下半薄切片玻片上无需涂胶，染色过程中较少出现某些文献报道的脱片7现象）。可间隔选取一张切片滴1%甲苯胺兰染色液置酒精灯上加热至热气冒出（勿沸腾，即所谓“近沸点染色”），然后自来水冲洗，观察形态，监视切片情况。选择形态较好的标本，间隔留片一张以获得连续切片，直到中轴切尽。
（2）脱脂
试剂配制：首先配制饱和氢氧化钠无水乙醇溶液9，必须静置一周以上，沉淀的氢氧化钠还会进一步溶解，最终溶液呈黄褐色油样。取上述溶液与甲苯按3∶1（体积比）混合成工作液（临用前配制，甲苯挥发性强，几小时后工作液中的甲苯便会挥发殆尽，可再次添加，这样饱和氢氧化钠乙醇溶液可以反复使）。
脱环氧树脂：将半薄切片置工作液中5~10min，无水酒精清洗5min×3 次，经梯度酒精（95%、90%、80%、70%、50%、25%各5 min）至水。脱脂成功的标志是观察标本周围的树脂是否已经消失。若是作下述Sato 法染色，梯度酒精至95%即可入水。
（3）染色
a.1%甲苯胺兰染色10
染液配制：
甲苯胺兰1g
硼砂1g
蒸馏水100ml
染色过程：
脱脂后标本滴1%甲苯胺兰染液后30 秒自来水洗即可，无需再加热。
b.次甲基蓝—碱性复红染色（Sato 等，1973）这是一步完成的多色性染色法，简单、迅速、可靠、可作为常规。
染液配制：
磷酸二氢钠0.5g
碱性复红0.25g
次甲基蓝0.2g
溶解于15ml 的0.5％硼酸溶液，连续搅拌，再加70ml 蒸馏水。最后加10ml 0.72％氢氧化钠溶液，使pH 达到6.8。溶液装瓶冰箱保存，用时摇动混匀、可连续使用数个月。若发现染液中有沉淀（多为复红）可以研碎后过滤。该染液用蒸馏水稀释一倍染色效果相同，可节省染液且染色时间比较好控制。
染色过程：
在软化和洗净的切片上，滴加稀释的次甲基蓝—碱性复红染液，于45~50℃热板或酒精灯上加热染色4~5 秒钟（不脱脂需加热，脱脂后无需加热）；自来水冲洗，室温干燥（勿用梯度酒精脱水，否则染料会退色）；二甲苯透明后中性树脂封闭，覆盖玻片；滴加香柏油后油镜下观察。染色时间随组织种类和所需观察的结构略有不同。需要加深染色时，可重复染色，其程度用显微镜控制。两种染色法染色过深均可以用1%盐酸酒精脱色，甚至可以将颜完全褪净，改行其他染色，进行同一客体的对比观察。
2.透射电镜研究：
已切过半薄切片的树脂块，切出定位角，再切厚片（0.7µm）后，1%甲苯胺兰染色，于显微镜下再次定位，再次修小定位，要求尽可能修小，修去标本的多余部份（注：已半薄切片的树脂块，在实体镜下通过光滑如镜的切面端，锇酸染成黑色的Corti 器清晰可见，根据要求也可直接选择所要的部份，不再半薄定位）超薄切片，铅染色后于JEM-1200EX 透射电镜下观察。两次修块如下图所示：
图 1 序贯修块示意图
外框为第一次半薄切片修块界限，内框为第二次超薄切片修块界限：
一、Sato染色法低倍镜下（×100）可见高质量的耳蜗过中轴全景，清晰显示氨基甙类抗生素从底圈到顶圈的损伤梯度，蜗尖可见细针所挑之孔（照片 1）。
一、材料
1.选用SD大鼠耳蜗氨基糖甙类抗生素损伤模型
2.取材：
氯胺酮肌注麻醉迅速断头取出内耳，细针挑破蜗尖，去除镫骨足板，置入4%多聚甲醛液中4℃固定24 小时，更换10%EDTA 液三天一次，脱钙两周。
3.后固定：选用上述脱钙后的耳蜗，在解剖显微镜下修小耳蜗标本（修去前庭部份，注意修剪出极性，勿修成正方形与圆形造成包埋困难）后，用0.01M 的PBS缓冲液漂洗，在1%锇酸中固定1.5 小时，然后再用0.01M 的PBS 缓冲液漂洗。
4.脱水：
梯度酒精：30%、50%各30 分钟，70%过夜，90%20 分钟。再经丙酮脱水：90%酒精+90%丙酮（1:1）20 分钟，90%丙酮20 分钟，100%丙酮20 分钟×3 次。以上脱水过程中，除100%丙酮脱水时于常温下外，其余各步均于4℃冰箱内进行。
5.浸透剂浸透：
纯丙酮+618 包埋液 2：1 室温 3～4h
纯丙酮+618 包埋液 1：2 室温 过夜
618 纯包埋液 37℃ 2～3h
6.平板定向包埋：在解剖镜下，蜗尖朝上，蜗轴与切片平面平行，埋入包埋槽，不建议使用胶囊包埋，定位比较困难。
7.固化：
37℃烘箱内 过夜
45℃烘箱内 12h
60℃烘箱内 24h
二、方法：
包埋后的同一标本进行两步研究，先行半薄切片光镜研究，再做常规透射电镜研究。
1.半薄切片光镜研究：
（1）制片
将环氧树脂包埋块用标本夹夹持，置解剖显微镜下，用锉刀与安全刀片修磨去掉样品周围的树脂，与常规电镜定位不同，仅修去多余树脂，尽量保留样品的最大面积，以便更多地保存标本材料中的信息，亦无需切出定位角。磨至中轴将近，于超薄切片机上用新制玻璃刀（勿用已超切标本的）切出厚度为1µm 的过中轴连续切片，捞片后置于载玻片蒸馏水滴上，在60℃恒温加热板上展片并烘干，切片便牢固地贴附于载玻片上（如不用买来后再次清洗过的玻片，1µm 以下半薄切片玻片上无需涂胶，染色过程中较少出现某些文献报道的脱片7现象）。可间隔选取一张切片滴1%甲苯胺兰染色液置酒精灯上加热至热气冒出（勿沸腾，即所谓“近沸点染色”），然后自来水冲洗，观察形态，监视切片情况。选择形态较好的标本，间隔留片一张以获得连续切片，直到中轴切尽。
（2）脱脂
试剂配制：首先配制饱和氢氧化钠无水乙醇溶液9，必须静置一周以上，沉淀的氢氧化钠还会进一步溶解，最终溶液呈黄褐色油样。取上述溶液与甲苯按3∶1（体积比）混合成工作液（临用前配制，甲苯挥发性强，几小时后工作液中的甲苯便会挥发殆尽，可再次添加，这样饱和氢氧化钠乙醇溶液可以反复使）。
脱环氧树脂：将半薄切片置工作液中5~10min，无水酒精清洗5min×3 次，经梯度酒精（95%、90%、80%、70%、50%、25%各5 min）至水。脱脂成功的标志是观察标本周围的树脂是否已经消失。若是作下述Sato 法染色，梯度酒精至95%即可入水。
（3）染色
a.1%甲苯胺兰染色10
染液配制：
甲苯胺兰1g
硼砂1g
蒸馏水100ml
染色过程：
脱脂后标本滴1%甲苯胺兰染液后30 秒自来水洗即可，无需再加热。
b.次甲基蓝—碱性复红染色（Sato 等，1973）这是一步完成的多色性染色法，简单、迅速、可靠、可作为常规。
染液配制：
磷酸二氢钠0.5g
碱性复红0.25g
次甲基蓝0.2g
溶解于15ml 的0.5％硼酸溶液，连续搅拌，再加70ml 蒸馏水。最后加10ml 0.72％氢氧化钠溶液，使pH 达到6.8。溶液装瓶冰箱保存，用时摇动混匀、可连续使用数个月。若发现染液中有沉淀（多为复红）可以研碎后过滤。该染液用蒸馏水稀释一倍染色效果相同，可节省染液且染色时间比较好控制。
染色过程：
在软化和洗净的切片上，滴加稀释的次甲基蓝—碱性复红染液，于45~50℃热板或酒精灯上加热染色4~5 秒钟（不脱脂需加热，脱脂后无需加热）；自来水冲洗，室温干燥（勿用梯度酒精脱水，否则染料会退色）；二甲苯透明后中性树脂封闭，覆盖玻片；滴加香柏油后油镜下观察。染色时间随组织种类和所需观察的结构略有不同。需要加深染色时，可重复染色，其程度用显微镜控制。两种染色法染色过深均可以用1%盐酸酒精脱色，甚至可以将颜完全褪净，改行其他染色，进行同一客体的对比观察。
2.透射电镜研究：
已切过半薄切片的树脂块，切出定位角，再切厚片（0.7µm）后，1%甲苯胺兰染色，于显微镜下再次定位，再次修小定位，要求尽可能修小，修去标本的多余部份（注：已半薄切片的树脂块，在实体镜下通过光滑如镜的切面端，锇酸染成黑色的Corti 器清晰可见，根据要求也可直接选择所要的部份，不再半薄定位）超薄切片，铅染色后于JEM-1200EX 透射电镜下观察。两次修块如下图所示：
图 1 序贯修块示意图
外框为第一次半薄切片修块界限，内框为第二次超薄切片修块界限：
一、Sato染色法低倍镜下（×100）可见高质量的耳蜗过中轴全景，清晰显示氨基甙类抗生素从底圈到顶圈的损伤梯度，蜗尖可见细针所挑之孔（照片 1）。
作者: cyberake
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