耳蜗半薄切片在形态学研究中的应用
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放大的壶腹嵴（×200）：
研究过程中，方法论具有深广的影响。本实验运用了一种经济、有效的非常规方法。
首先是包埋方式的改进，电镜学家一贯强调取材、固定时标本要尽可能小，以利固定，迫使耳科研究者不得不在标本脱钙后在实体显微镜下剥去蜗壳，分段取出耳蜗各部分组织包埋，这需要一定的技巧，也会损失一些标本，产生一些伪像，也使得下述半薄切片的应用受到一定的限制。经过我们的比较研究，大鼠、小鼠的耳蜗完全可以不去蜗壳，整体包埋，这主要是因为耳蜗并非一般的实体组织，蜗壳中多隧道，其内充满液体，只要挑破蜗尖，去除镫骨，固定液便可以充分渗透，达到固定的目的。这样既简化了步骤、减少了操作带来的伪像，也为半薄切片的研究方法创造了便利的条件。
其次是精细光镜观察方法的引进。分辨率是指显微镜、人眼分辨两个质点之间最小距离的能力。1874 年德国科学家阿贝（Ernest Abbe），根据衍射理论推导出提出显微镜理论明确显微镜分辨本领的极限，瑞利（Rayleigh）将阿贝衍射理论归纳为一个公式：δ≥0.61λ/（n×sinθ）
即瑞利判据。该判据表明，当且仅当物体上两点之间的距离δ 大于不等式右边所规定的量时，才被看作是分开的两点。这个量与入射光波长λ、折射率n以及显微物镜的半孔径角θ 有关。通常n<2，sin（θ）<1，所以可分辨的距离δ 一般不小于l/2λ。据此可知，提高分辨率的方法包括：选择非常短的辐射波长，如利用紫外光、x 射线、电子等；提高折射率n 或显微镜的半孔径角θ，如选用油镜。但除了用电子替代光子的方法会明显地提高分辨率外，其他解决办法只能稍微改善分辨率。经过长达三个世纪的不断改进，现代光镜已很完善，性能已达到设计的理论极限，其分变率高达0.2µm，可将人眼分辨率（0.2mm）提高1000 倍。如果再增加放大率，将会遇到使物像畸变和弯曲的透镜像差和使物像边缘模糊的衍射像差。前者系透镜本身固有缺陷，通过矫正可减小到极限值，使最高放大率达到1000~1500 倍；后者是由光线波长（衍射效应）决定的，无法消除。由于衍射效应，光镜不能识别小于可见光平均波长（0.5µm） l/2 以下的物体。因此，提高光镜分辨率的根本途径是改善标本制备技术，其中最重要和最基本的是半薄切片技术。由于石蜡切片过厚（5µm）及组织细胞成分因各种化学处置而保存不佳，造成很多细节重叠、破坏或丢失，石蜡切片在光镜下显示的结构细节，—般达不到固有分辨程度。而石蜡包埋剂的机械特性，即使用理想的切片刀，也难切得lµm 以下的薄片。树脂包埋剂和玻璃刀的应用，即半薄切片的诞生，克服了生物标本薄切的困准。半薄切片（Semi-thin section）系厚度在0.5~1.0µm 的薄片（厚度为5µm石蜡切片的1/l0~1/5）、面积达1mm2 以上。这种切片薄至可见光的平均波长，加上制备技术能使组织细胞成分更大限度地保存，因而具有光学高分辨特性，所显示的细胞学细节是任何最好的石蜡切片不能比拟的，拍摄的照片放大后，能呈现颇似低倍的电镜图像。所以可以说，半薄切片兼有光镜与电镜的优点。目前在神经、肾、皮肤等组织的研究中已有不少成功的先例，可是耳病理领域鲜有使用。
表格 6 石蜡切片、半薄切片比较表：
石蜡切片 半薄切片
包埋剂 石蜡 树脂
切片刀 金属 玻璃
厚度（µm） ≥4 0.5~1
分辨率 低 高
染色 脱蜡后 脱脂后
制片时间 3d 4d
这种为适应电子显微镜术进行的制样技术在研究耳蜗过程中却带来另外两种缺陷，就是标本切面面积的明显缩小和树脂切片染色困难。过去半薄切片只用于包埋块的筛选定位，所以要求切片前应将树脂块尽可能修小，这样研究单个Corti 器尚可，但无法研究整个耳蜗。所以在本研究中，我们尽可能修去内耳前庭部分，修块时尽可能大，最后发现大、小鼠耳蜗，都恰好可以埋入常规包埋槽，按常规半薄切片方法均可以获得满意的耳蜗全貌。豚鼠耳蜗比较大，一次完全埋入有困难，可以分步包埋或者取感兴趣的部分包埋。笔者认为该法可以作为今后光镜研究大、小鼠耳蜗的常规方法。
既往半薄切片由于仅供定位使用，盐基染料如甲苯胺兰、美兰、结晶紫，碱性品红、硫堇等可直接染色，只需加热至近沸点即可，多被采用，其中1%甲苯胺兰便是最常用的。不过这是单色性染色，只有一种颜色，与平时习惯的红蓝双色的HE 染色不同，而且提供的信息亦较少。甲苯胺兰染色，进行计数研究尚可，但是做精细光镜研究则有所不逮。
染色困难可以通过脱脂和染色方法的改进加以解决。生物标本经锇酸固定和环氧树脂包埋后，之所以难用普通光学染料显示，主要是由于聚合的环氧树脂不易被染液穿透，以及饿酸“封闭”了细胞中与染料起反应的嗜酸或嗜碱性基团（若是不用锇酸后固定，一旦想进一步电镜研究便有困难，而且标本被锇酸染成黑色有利于包埋和修块，所以不建议免去锇酸固定的步骤）。因此，半薄切片直接染色往往得不到令人满意的结果。为取得稳定的染色效果，可以从四个方面促进染色：脱除包埋剂、氧化切片、使用高pH 值染、加温。文献报道与我们的实践均证明脱除包埋剂后的半薄切片，几乎能作各种光学染色，无论用单色性抑或多色性染色，一般都能取得良好效果，除非染色结果欠佳才考虑采用氧化、碱化与加温的方法。
脱包埋剂方法：Mayof（1961）提出使用甲氧化钠溶液，但由于配制不够安全，现在多采用后来发展的用无水酒精、丙酮、环氧丙烷、二甲苯配制的氢氧化钠或氢氧化钾饱和溶液。实际上，为取得良好染色效果，并不必完全脱包埋剂，半脱包埋剂更好。经典的脱树脂方法是切片于饱和氢氧化钠无水酒精溶液浸置24 小时，能使聚合的树脂“解联”、张力降低和切片表面树脂脱失，而切片内部残存的薄层树脂，尚有助于维持细胞形态。不过该法耗时，且容易脱片。在本次实验中采用简易、快捷的改良脱树脂方法，总时间不过半小时，这一半脱包埋剂或“软化”的方法可作为常规方法使用。脱脂的半薄切片可作多种光学染色。下面仅就适用于常规工作的几种单色性和多色性染色方法简单讨论。单色性染色如甲苯胺兰染色，脱脂后的半薄切片较脱脂前效果好，色彩层次稍丰富，不过仍旧不及多色性染色。多色性染色能够取得颇似HE 染色的效果，同时兼有若干光学特殊染色的特点，细胞与间质，以及细胞诸成分之间形成明确的反差，具有高分辨的数种光学染色的综合特征，在高倍镜或油镜下呈现令人鼓舞的非凡细节，适用于精细观察、定位和照相。多色染色方法较多，本实验中比较了常规HE、吉姆萨、吉姆萨——瑞氏染色法，甲苯胺兰与美兰染色法。HE 染色主要问题是苏木精着色较浅，尽管使用氧化、碱化、加温甚至微波 等手段费时费力，效果仍欠满意。吉姆萨、吉姆萨——瑞氏染色法可以不脱脂进行，不过唯独Corti器细胞着色特别浅，无法应用于研究。甲苯胺兰混合美兰染色，由于两者基本上均呈蓝色，类似于单色性染色。比较中发现Sato 染色法方法简便、迅速，能够显示更多细节，如能够清晰显示细胞表面分化结构（如纤毛、微绒毛）、核及核仁的形态、以及一些胞浆颗粒等成分。在染色适当的切片还能清晰辨别细胞边界。其所呈现的惊人的分辨率，无疑将成为细胞学精细研究的重要光学手段。半薄切片与电镜可进行序贯研究，既可以兼顾研究的广度和深度，又有可比性，最大限度的获取信息量，还极大的节省了标本，经济有效，建议大力提倡。文献报道半薄切片可以作银染等特殊染色，甚至可行免疫组化染色，本实验中曾试行细胞角蛋白免疫组化染色并未成功，而同期对照的冰冻切片、石蜡切片却可行，或许与抗原种类有关，有待进一步探索。
本次研究中采用此方法建立了电镜像与半薄切片下的精细光镜像的一一对应关系，再运用光镜广泛地抽样计数统计，方得出了比较可靠的结论。试想仅根据一两次“片面”“管窥”能否得出令人信服的结论？若是采用电镜计数理论上虽然可行，可是在实践中费力、费时、费钱，达到同样多的样本量几乎是不可能的。
结论：
可见，半薄切片分辨率介于石蜡与超薄切片之间，是光学与超微水平之间的过渡环节，进行对比分析，会提高观测的速度和质量。半薄切片与电镜可进行序贯研究，兼顾研究的广度和深度，可进行细胞计数统计，并极大的节省了标本。综上所述这种研究方法兼有光、电镜之长，又弥补了二者的缺陷，可以推动内耳超微病理学发展。
想想当年埋头于实验室中的情景，感慨良多。
从一个只知道看病理报告结论的临床医生训练到会作常规病理、冰冻切片、半薄切片的试验者，从专门做内耳到做中耳、咽鼓管、鼻腔粘膜，直到做肝、脾、肾、脑、眼、皮肤、睾丸、肌肉等等，从HE染色到组织化学、免疫组织化学，经历了多少痛苦的尝试，不过现在开玩笑时对人夸口如果我下岗了，至少可以到病理科做个技术员。
痛苦是一份宝贵的财富，特别是当你日后笑对它的时候！
编辑：西门吹血
研究过程中，方法论具有深广的影响。本实验运用了一种经济、有效的非常规方法。
首先是包埋方式的改进，电镜学家一贯强调取材、固定时标本要尽可能小，以利固定，迫使耳科研究者不得不在标本脱钙后在实体显微镜下剥去蜗壳，分段取出耳蜗各部分组织包埋，这需要一定的技巧，也会损失一些标本，产生一些伪像，也使得下述半薄切片的应用受到一定的限制。经过我们的比较研究，大鼠、小鼠的耳蜗完全可以不去蜗壳，整体包埋，这主要是因为耳蜗并非一般的实体组织，蜗壳中多隧道，其内充满液体，只要挑破蜗尖，去除镫骨，固定液便可以充分渗透，达到固定的目的。这样既简化了步骤、减少了操作带来的伪像，也为半薄切片的研究方法创造了便利的条件。
其次是精细光镜观察方法的引进。分辨率是指显微镜、人眼分辨两个质点之间最小距离的能力。1874 年德国科学家阿贝（Ernest Abbe），根据衍射理论推导出提出显微镜理论明确显微镜分辨本领的极限，瑞利（Rayleigh）将阿贝衍射理论归纳为一个公式：δ≥0.61λ/（n×sinθ）
即瑞利判据。该判据表明，当且仅当物体上两点之间的距离δ 大于不等式右边所规定的量时，才被看作是分开的两点。这个量与入射光波长λ、折射率n以及显微物镜的半孔径角θ 有关。通常n<2，sin（θ）<1，所以可分辨的距离δ 一般不小于l/2λ。据此可知，提高分辨率的方法包括：选择非常短的辐射波长，如利用紫外光、x 射线、电子等；提高折射率n 或显微镜的半孔径角θ，如选用油镜。但除了用电子替代光子的方法会明显地提高分辨率外，其他解决办法只能稍微改善分辨率。经过长达三个世纪的不断改进，现代光镜已很完善，性能已达到设计的理论极限，其分变率高达0.2µm，可将人眼分辨率（0.2mm）提高1000 倍。如果再增加放大率，将会遇到使物像畸变和弯曲的透镜像差和使物像边缘模糊的衍射像差。前者系透镜本身固有缺陷，通过矫正可减小到极限值，使最高放大率达到1000~1500 倍；后者是由光线波长（衍射效应）决定的，无法消除。由于衍射效应，光镜不能识别小于可见光平均波长（0.5µm） l/2 以下的物体。因此，提高光镜分辨率的根本途径是改善标本制备技术，其中最重要和最基本的是半薄切片技术。由于石蜡切片过厚（5µm）及组织细胞成分因各种化学处置而保存不佳，造成很多细节重叠、破坏或丢失，石蜡切片在光镜下显示的结构细节，—般达不到固有分辨程度。而石蜡包埋剂的机械特性，即使用理想的切片刀，也难切得lµm 以下的薄片。树脂包埋剂和玻璃刀的应用，即半薄切片的诞生，克服了生物标本薄切的困准。半薄切片（Semi-thin section）系厚度在0.5~1.0µm 的薄片（厚度为5µm石蜡切片的1/l0~1/5）、面积达1mm2 以上。这种切片薄至可见光的平均波长，加上制备技术能使组织细胞成分更大限度地保存，因而具有光学高分辨特性，所显示的细胞学细节是任何最好的石蜡切片不能比拟的，拍摄的照片放大后，能呈现颇似低倍的电镜图像。所以可以说，半薄切片兼有光镜与电镜的优点。目前在神经、肾、皮肤等组织的研究中已有不少成功的先例，可是耳病理领域鲜有使用。
表格 6 石蜡切片、半薄切片比较表：
石蜡切片 半薄切片
包埋剂 石蜡 树脂
切片刀 金属 玻璃
厚度（µm） ≥4 0.5~1
分辨率 低 高
染色 脱蜡后 脱脂后
制片时间 3d 4d
这种为适应电子显微镜术进行的制样技术在研究耳蜗过程中却带来另外两种缺陷，就是标本切面面积的明显缩小和树脂切片染色困难。过去半薄切片只用于包埋块的筛选定位，所以要求切片前应将树脂块尽可能修小，这样研究单个Corti 器尚可，但无法研究整个耳蜗。所以在本研究中，我们尽可能修去内耳前庭部分，修块时尽可能大，最后发现大、小鼠耳蜗，都恰好可以埋入常规包埋槽，按常规半薄切片方法均可以获得满意的耳蜗全貌。豚鼠耳蜗比较大，一次完全埋入有困难，可以分步包埋或者取感兴趣的部分包埋。笔者认为该法可以作为今后光镜研究大、小鼠耳蜗的常规方法。
既往半薄切片由于仅供定位使用，盐基染料如甲苯胺兰、美兰、结晶紫，碱性品红、硫堇等可直接染色，只需加热至近沸点即可，多被采用，其中1%甲苯胺兰便是最常用的。不过这是单色性染色，只有一种颜色，与平时习惯的红蓝双色的HE 染色不同，而且提供的信息亦较少。甲苯胺兰染色，进行计数研究尚可，但是做精细光镜研究则有所不逮。
染色困难可以通过脱脂和染色方法的改进加以解决。生物标本经锇酸固定和环氧树脂包埋后，之所以难用普通光学染料显示，主要是由于聚合的环氧树脂不易被染液穿透，以及饿酸“封闭”了细胞中与染料起反应的嗜酸或嗜碱性基团（若是不用锇酸后固定，一旦想进一步电镜研究便有困难，而且标本被锇酸染成黑色有利于包埋和修块，所以不建议免去锇酸固定的步骤）。因此，半薄切片直接染色往往得不到令人满意的结果。为取得稳定的染色效果，可以从四个方面促进染色：脱除包埋剂、氧化切片、使用高pH 值染、加温。文献报道与我们的实践均证明脱除包埋剂后的半薄切片，几乎能作各种光学染色，无论用单色性抑或多色性染色，一般都能取得良好效果，除非染色结果欠佳才考虑采用氧化、碱化与加温的方法。
脱包埋剂方法：Mayof（1961）提出使用甲氧化钠溶液，但由于配制不够安全，现在多采用后来发展的用无水酒精、丙酮、环氧丙烷、二甲苯配制的氢氧化钠或氢氧化钾饱和溶液。实际上，为取得良好染色效果，并不必完全脱包埋剂，半脱包埋剂更好。经典的脱树脂方法是切片于饱和氢氧化钠无水酒精溶液浸置24 小时，能使聚合的树脂“解联”、张力降低和切片表面树脂脱失，而切片内部残存的薄层树脂，尚有助于维持细胞形态。不过该法耗时，且容易脱片。在本次实验中采用简易、快捷的改良脱树脂方法，总时间不过半小时，这一半脱包埋剂或“软化”的方法可作为常规方法使用。脱脂的半薄切片可作多种光学染色。下面仅就适用于常规工作的几种单色性和多色性染色方法简单讨论。单色性染色如甲苯胺兰染色，脱脂后的半薄切片较脱脂前效果好，色彩层次稍丰富，不过仍旧不及多色性染色。多色性染色能够取得颇似HE 染色的效果，同时兼有若干光学特殊染色的特点，细胞与间质，以及细胞诸成分之间形成明确的反差，具有高分辨的数种光学染色的综合特征，在高倍镜或油镜下呈现令人鼓舞的非凡细节，适用于精细观察、定位和照相。多色染色方法较多，本实验中比较了常规HE、吉姆萨、吉姆萨——瑞氏染色法，甲苯胺兰与美兰染色法。HE 染色主要问题是苏木精着色较浅，尽管使用氧化、碱化、加温甚至微波 等手段费时费力，效果仍欠满意。吉姆萨、吉姆萨——瑞氏染色法可以不脱脂进行，不过唯独Corti器细胞着色特别浅，无法应用于研究。甲苯胺兰混合美兰染色，由于两者基本上均呈蓝色，类似于单色性染色。比较中发现Sato 染色法方法简便、迅速，能够显示更多细节，如能够清晰显示细胞表面分化结构（如纤毛、微绒毛）、核及核仁的形态、以及一些胞浆颗粒等成分。在染色适当的切片还能清晰辨别细胞边界。其所呈现的惊人的分辨率，无疑将成为细胞学精细研究的重要光学手段。半薄切片与电镜可进行序贯研究，既可以兼顾研究的广度和深度，又有可比性，最大限度的获取信息量，还极大的节省了标本，经济有效，建议大力提倡。文献报道半薄切片可以作银染等特殊染色，甚至可行免疫组化染色，本实验中曾试行细胞角蛋白免疫组化染色并未成功，而同期对照的冰冻切片、石蜡切片却可行，或许与抗原种类有关，有待进一步探索。
本次研究中采用此方法建立了电镜像与半薄切片下的精细光镜像的一一对应关系，再运用光镜广泛地抽样计数统计，方得出了比较可靠的结论。试想仅根据一两次“片面”“管窥”能否得出令人信服的结论？若是采用电镜计数理论上虽然可行，可是在实践中费力、费时、费钱，达到同样多的样本量几乎是不可能的。
结论：
可见，半薄切片分辨率介于石蜡与超薄切片之间，是光学与超微水平之间的过渡环节，进行对比分析，会提高观测的速度和质量。半薄切片与电镜可进行序贯研究，兼顾研究的广度和深度，可进行细胞计数统计，并极大的节省了标本。综上所述这种研究方法兼有光、电镜之长，又弥补了二者的缺陷，可以推动内耳超微病理学发展。
想想当年埋头于实验室中的情景，感慨良多。
从一个只知道看病理报告结论的临床医生训练到会作常规病理、冰冻切片、半薄切片的试验者，从专门做内耳到做中耳、咽鼓管、鼻腔粘膜，直到做肝、脾、肾、脑、眼、皮肤、睾丸、肌肉等等，从HE染色到组织化学、免疫组织化学，经历了多少痛苦的尝试，不过现在开玩笑时对人夸口如果我下岗了，至少可以到病理科做个技术员。
痛苦是一份宝贵的财富，特别是当你日后笑对它的时候！
编辑：西门吹血
作者: cyberake
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