dxy

方法再详尽点:

3.1 1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：
　　3.1.1 测试样品 ( 2 ul / each )
　　3.1.1.1 直接取样测试细胞之培养液。
　　3.1.1.2 Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )
　　3.1.1.3 Negative control : ddH2O
　　3.1.2 Reaction mixture ( 23 ul / each )
　　3.1.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
　　3.1.2.2 1st stage primer mixture 0.5 ul
　　3.1.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l
　　3.1.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
　　3.1.2.5 Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul
　　3.1.2.6 ddH2O 18.4 ul
　　3.1.3 PCR program ( 1st PCR与2 nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler
　　3.1.3.1 step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
　　3.1.3.2 step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
　　3.1.3.3 step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min
　　3.1.3.4 step 4 : extension: 72 ℃ 2 min
　　3.1.3.5 重复3.1.3.2至3.1.3.4步骤30 cycles
　　3.1.3.6 step 5 : final extension 72 ℃ 5 min
　　3.2 2 nd stage PCR reaction（total volume 25 ul）
　　3.2.1 测试样品：1st stage PCR product（1 ul / each）。
　　3.2.2 Reaction mixture ( 24 ul / each )
　　3.3.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
　　3.3.2.2 2 nd stage primer mixture 0.5 ul
　　3.3.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul
　　3.3.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
　　3.3.2.5 Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul
　　3.3.2.6 ddH2O 19.4 ul
　　3.2.3 PCR program同3.1.3；使用PCR thermal cycler

4.0 胶片电泳分析
　　4.1 胶片 (2.0%) 置备: 将2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。
　　4.2 电泳液：(1x) TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer）
　　4.3 选择100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )
　　4.4 取10 ul 2 nd stage PCR产物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。
　　4.5 进行电泳分离100V, 25 min。
　　4.6 胶片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。（EtBr为致癌物质，请戴手套并小心操作）
　　4.7 结果：使用UV light观察，并照相记录。

Figure 1 : Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. ( from ATCC mycoplasma detection kit)

Table 1 : Variations of restriction fragment lengths of the 16S-23S rRNA intergenic spacer regions of commonly encountered species of mycoplasma. (from ATCC mycoplasma detection kit)
　　* No restriction site
　　** When a polyacrylamide gel is used for the resolution of amplified DNA products, a double-band product with one bp difference may be observed for M. hominis. This feature can serve as a good indicator for differentiated M. hominis from M. arginini, which only produces a single-band DNA product.

网友“zllxash”提供支原体污染的细胞在光学显微镜下的照片：如下