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网友[泡泡游]：

LDH释放法
酸脱氢酶（LDH）在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤%。本法操作简便快捷，自然释放率低，可用于CTL及NK细胞活性测定及药物、化学物质或放射引起的细胞毒性，现已有LDH法测定CTL活性试剂盒（promega）。应注意较高浓度FCS中所含LDH可能干扰结果。

51铬（Cr）释放法，本法结果准确、重复性好，但也存在以下不足：①使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器；②51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定；③51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验；④细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。

荧光测定法：
如： alamarBlue一步荧光测定法
alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。具体测定方法是：在靶细胞孔（T）、效应细胞孔（E）和实验孔（T+E）各加alamarBlue，共育6～24h后用板式荧光测定仪测530nm（发射）/590nm（散射）波长荧光强度，将T及E孔荧光均值相加后减去实验孔（T+E）荧光均值，与T孔荧光均值比较即可计算CTL对靶细胞的溶解%。本法与51Cr释放法纺织厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤，适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×10⁵/孔即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果。

网友[大灰熊]：

用MTT法中的一些体会：
1、细胞数要尽可能的多，在细胞数足够多的情况下，可以避免一些上述园友提及的一些误差。
2、要有足够多的复孔，我一般每个剂量设8个复孔。我做了100多块板子后发现只要有足够的细胞数和复孔数，MTT法的重复性还是可以的。前几天测了几种物质对细胞活性的影响，基本上和我在2年前测得结果一致。

总之，我觉得统计学中关于试验设计中要有足够的样本数很重要，大样本数可以极大降低实验中的误差，增强实验结果的可靠性和重复性。

网友[littlenoodle]：

我们课体组是在2004年使用的CCK-8试剂盒，检测原代分离的小鼠T淋巴细胞增殖。之前也使用过[3H]-TdR和MTT法，但由于原代T细胞的特点：1、细胞为悬浮；2、细胞体积小；3、原代细胞存活和增殖较细胞系困难。并且实验中涉及功能阻断，所以我用MTT的精确性不够高，多次用[3H]-TdR考虑到安全性不够好。就改用了CCK-8检测增殖。

我使用96孔细胞培养板，每孔4×10⁵ 个T细胞，PHA或ConA加入活化细胞后检测，每孔20μl，注意不要产生气泡，防止影响读板，因为这些小泡即使用针尖也无法消除。放回培养箱，4 h后取出，酶标仪550nm读板，虽然要求的是450nm，但我室没有安装这一波长的滤光片，所以就用了550nm，从结果上看趋势还是很好的。

保存：由于买的量大，所以为维持产品稳定性，先将不用的都保存在－20℃，并且使用过程中尽量避光，用完立即放回4℃。

另外，在培养贴壁细胞（如星形胶质细胞）的过程中，加CCK-8之前可先用水平式离心机去除培养基，加入含10％CCK-8的培养基,培养30 min后检测。这种方法在没有多道移液器，可能导致加入的CCK-8量不同的情况下可供使用。在加入CCK-8后不同时间检测，数值会有所升高，但总的趋势不会变。另外，要像做ELISA一样，在培养板上设立各种严格的对照组，每组3孔，以便去除本底，做出准确的变化曲线。

但所有细胞的活力要求必须要好，否则不增殖，测不出太大的变化。

网友[spiderman020389]：

做MTT之前，要首先就你所要做的细胞，不加药的情况下，测定细胞作用的时间以及不同细胞数情况下，检测出其OD值，使你的OD值在0.75－1.25之间，也就是找出最优的时间点和细胞数。同样在实验过程中还要注意MTT避光，避免污染，培养基污染，以及细胞数过高过低现象及复孔（我实验过程中每浓度设置了10复孔），好多的细节需要注意，尽管是一个不太杂的实验。

网友[樱桃子]：

1、感觉MTT方法所得出的结果重复性不太好，虽然多次试验的总体趋势是一致的，但每次得出的IC50值相差挺大，结果标准差也相差很大。
2、改用CCK-8，感觉操作步骤简单，这样就减少了操作产生误差的机会。结果也稳定了许多。
3、我个在使用CCK-8中得出的很重要的经验是：如果待测培养系统（如药物）本身是有色的，特别是黄色，那么一定要注意设好对照。因为CCK-8生成的产物也是黄色的，这样会干扰实验结果。设立对照方法如下：
细胞对照孔：细胞+培养液
药物对照孔：药物+培养液 各浓度组药物都要分别设立
培养液对照孔：用于整块培养板调零
4、如果想发SCI的文章，还是选用国际上承认的方法，现在好像MTT发SCI有点悬。

网友[hotgray]：

我做MTT 做了很多，只要你每次的条件摸的差不多，MTT 的准确率还是可以的，虽然每次测得同一个孔的值，都不一样，但是IC50值，差别不大的。我的经验就是要把，孔的倍数拉开，这样就容易形成剃度，IC50值就比较稳定了。之后在在大致的范围内，缩小倍数 ，多次测，可以得到一个可靠的IC50值。

网友[haizhitang]：

我用CCK-8检测原代大鼠肝脏细胞。
实验方法：
1、分离原代大鼠肝脏细胞，以3×10⁵/ml浓度将细胞铺于96孔细胞培养板中，贴壁培养。
2、贴壁培养4小时后，加入待测药物，作用相应时间。
3、每孔加入10ul CCK-8溶液，放入细胞培养箱中继续培养3－4小时，450nm读取吸光值。

注意事项：
由于是贴壁培养的细胞，在读吸光值时细胞培养板底部附着的细胞可能会对数值有一定的影响，因此建议在加入CCK-8 3－4小时后，将上清液重新吸取到另一干净的酶标板中进行读值，保证检测的准确性。
要防止反复使用同一瓶试剂后可能造成的试剂污染。

该试剂盒灵敏度较高，在细胞数较少的情况下也能区别出不同浓度药物作用后的细胞活性差别，比传统的MTT法要灵敏许多，同时，其操作比较简单，节省实验操作时间。

网友[wangzhua]：

SRB，也叫磺基罗丹明B，是在酸性条件下可特异性地与细胞内蛋白结合的染料，SRB染色后不象MTT那样很容易变色，染色后干燥的板子可以放置较长时间，而后再用Tris碱液溶解SRB，比色测定，对结果没有影响。所以，不同时间测试的板子可以同一时间测定，即使溶解后，较长时间测定也没有明显影响。

测定方法：
细胞加药培养48小时后，取出培养板，于每孔加入50ul预冷的50%三氯醋酸，静置5分钟后移入4℃冰箱中静置1小时，取出用去离子水洗5遍，空气中干燥，待完全干燥后每孔加入1%的乙酸配制的0.4%的SRB 100ul，染色20分钟后倒掉染液，用1%乙酸洗5次，去除未结合的染料。空气中干燥后用pH 10.5的10mmol/L的非缓冲Tris碱液150ul溶解，在平板振荡器上振荡5分钟，在BioRad酶标仪上测定各孔在490nm的光吸收。本底对照板的细胞同样处理测定OD490。
有关专家透露，新的抗肿瘤药指导原则中将选用此方法作为细胞毒活性测定的最佳方法。