细胞活性测定方法专题讨论
转载请注明来自丁香园
网友[awei]：
ATP含量测定，目前已经被大家接受为一种细胞活力检测指标，国外的相关文献已经有不少，我也是从文献知道的。目前国外已经有几家公司专门卖这种试剂盒了，国内也有，好象是壁云天公司。其原理是荧光素酶与荧光素反应时需要ATP，当用饱和浓度的荧光素酶和荧光素反应是，其发光量于ATP之间是存在定量关系的，具体来讲是它们的LOG值呈线性相关，这样就可以通过荧光值得到ATP的含量了。一般来讲，样品中的ATP量是不大的，因此一般情况下是不需要荧光素酶的饱和剂量，这样太浪费试剂，但个别情况下ATP含量奇高，就需要这样作了。我做过几次，实验的可重复性明显好于MTT。在作MTT时由于它的变异度较大，不得不加大样本量，但ATP含量测定其稳定性较好，样本量一般不需要很大，我一般每一个分组有四，五个样品足够了。
网友[jjw703]：
1、台盼蓝染色法，对于悬浮细胞来说，还比较方便，对贴壁细胞来说，较为繁琐。因为要消化，有时，96孔板不一定能消化干净。而且，该法是测定细胞浓度的方法，与细胞悬液的体积有关，加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说，该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰。
2、克隆（集落）形成法，对贴壁细胞来说，较为方便，也较客观。但要注意（1）一定要将细胞充分分散，边摇边加入孔板中；（2）用枪加到孔板时，用力柔和，避免细胞冲到孔板的壁而沉下，导致细胞克隆在孔板的四周较多，中间较少，细胞克隆集中于四周，导致计数误差。
3、MTT法，测定的是细胞浓度，要注意细胞悬液的体积。血清蛋白对实验测定有干扰，要弃上清，加入一定量的SDS或DMSO溶解沉淀物，这两步都会给实验带来误差。而且在96孔上操作，实验孔较多时，加样次数越少越好。所以，该法如斑竹所说，会有误差。
4、CCK－8的实验，只加样一次，实验比MTT法简单，比台盼蓝染色法客观，它的缺点有两方面：
（1）比较贵；
（2）加入CCK8试剂后，一般要放入CO2箱1-2.5小时，保温时间越长，测定A值越高，虽然每一孔的A值都增加了，但不同的孵育时间，测定的IC50还是不同的，但IC50改变不大。
本来细胞浓度测定，测定的细胞浓度是相对值，无论台盼蓝染色法，MTT法，CCK8法都是相对准确的实验，在此意义上，CCK8可以说是比较方便，准确，客观的方法。我们小组的经验是
1、酚红的颜色可能影响实验结果（都是橙黄色），若实验的试剂空白组A大于0.2，则实验体系用无酚红的1640（有售），否则，则不怕/忽略酚红的影响。
2、每次实验，不同孵育时间，A值不一样，以“细胞对照组A＝1.0左右”为最佳孵育时间，每次实验与此统一。
网友[jiyi923]：
给大家介绍一种测定细胞活性的方法，大家可以自己跟MTT比较一下。
原理：Sulforhodamine B （SR）是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的OD读数与细胞数呈良好的线形关系，故可用做细胞数的定量。
材料与方法：
1、其细胞接种与MTT相同。
2、SRB用1%醋酸配成0.4%溶液。细胞在加药培养结束后用三氯醋酸（TCA）固定：贴壁细胞每个小孔加预冷的50%TCA液50ul（终浓度为10%）固定；悬浮细胞每孔加预冷的80%TCA50ul固定，加TCA时必须轻轻加在培养液表面，静置5分钟后再将平板移至4度放置1小时，这样可使悬浮细胞固定在培养孔的底部。
3、倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。
4、每孔加如100ulSRB液，在室温放置10分钟。未与蛋白结合的SRB用1%醋酸液洗5遍，空气干燥。
5、结合的SRB用150ul 10mmol/l非缓冲Tris碱液（ph10.5）溶解。
6、用自动化分光光度平板读数计在515nm波长处测定每个小孔的OD值。
本法用TCA固定细胞后，可随时用SRB作蛋白含量测定，不受测定时间的影响。SRB用tris溶解后也可稳定一个较长的时期。OD与SRB浓度作图时，在OD 单位1.5-2.0间为线性，当超出线形范围时，必须稀释后重新读数。
MTT操作过程中必须吸出细胞培养的上清液，使之比较费时及增加可能的误差，大量使用DMSO也不受欢迎。此外，OD值随时间变化也是一个较大的缺点。当然SRB法操作比MTT复杂一点，但是时间可以自己掌握，不受测试时间的限制。
网友[CindyGloria]：
Trypan Blue 台盼蓝排斥试验，比较适合原代培养的细胞。
原理：
细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。还有其他燃料，如伊红Y和苯胺黑等。
用品：
1. 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。
2. 吸管、血细胞计数板、显微镜
步骤：
1、制备单细胞悬液。并作适当稀释（10 *6 细胞/ml）
2、染色：取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴0.4%台盼蓝溶液，混匀。
3、计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞
结果：
镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。
根据下式求细胞活力：
活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）*100
注意事项：台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。
台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时，细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色，在显微镜下观察即可，活细胞不被染色。方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。
网友[lalala_2004]：
台盼兰染色法价格低廉，操作简单，又不用无菌操作，做这个实验只要是把显微镜调好了，细胞浓度调好了就不会有问题，是一个养细胞的入门实验，所以很适合初学者做。我做这个实验主要是用来确定抑制细胞增殖的药物浓度，排除浓度过大引起的毒性反应。
MTT性价比最高，操作上也不复杂但是也要注意一些地方：
1、刚开始做MTT 实验的时候，结果的稳定性及重复性不好，后来查资料发现，MTT实验的最后OD值要控制在0.75－－1.25之间，这样才能保证数据有线性关系。在先控制好了合适的培养时间和细胞数后，所得到的数据还是令人满意的。
2、一定要保证每孔细胞数相同，这一点很重要，所以一定要充分混匀，边加边吹打，尽快加完。
3、尽量用新的96孔板，同时加样时注意准确，吸弃上清时，尽量小心，不要吸起沉淀，以减小误差。
4、血清浓度对MTT实验也有影响，尽量不高于5％，因为如果蛋白质含量高了，加入MTT反应后会有蛋白沉淀出现，最后的沉淀很难溶。
5、MTT试剂一定要注意避光，如果变绿了，就绝不能用了。
网友[细雨纷飞]：
改良MTT法在细胞活性测定中的应用：
原来的MTT法操作起来比较烦琐，要求技术熟练，但是结果的重复性比较差，因此我们在细胞增殖试验中采用了改良的MTT法，具体步骤如下：
1、细胞接种（96孔板），每孔100μl，细胞量2～5×104个（细胞数量将决定加入裂解液之后的孵育时间）。
2、根据聚体要求进行处理，处理物的量一般为10μl。
3、处理完之后直接加入10μlMTT，继续培养4小时。
4、直接加入裂解液100μl，裂解的时间由接种的细胞量决定，2～5×104个细胞，4小时可充分裂解，如果细胞数目比较大，就要延长孵育的时间。
（裂解液的配比：100ml的N,N-二甲基甲酰胺，100ml蒸馏水，30gSDS（十二烷基硫酸钠）；搅拌待SDS充分溶解之后过滤，过滤得到的液体即可直接应用）
5、裂解完毕之后在振荡器上振荡10min，酶标仪测定。
本方法的方便之处是不要反复吸出液体，减少了操作不当影响结果，每次操作只要直接加入液体就可以了，但是加入的量要按上述说过的量，要不就会溢出孔外，重点是裂解液的配比。
如果要了解的更加聚体，可以参考“改良MTT法检测HEPG-2细胞的增殖”，发表在今年6月份这一期的《卫生毒理学杂志》。
编辑：bluelove
ATP含量测定，目前已经被大家接受为一种细胞活力检测指标，国外的相关文献已经有不少，我也是从文献知道的。目前国外已经有几家公司专门卖这种试剂盒了，国内也有，好象是壁云天公司。其原理是荧光素酶与荧光素反应时需要ATP，当用饱和浓度的荧光素酶和荧光素反应是，其发光量于ATP之间是存在定量关系的，具体来讲是它们的LOG值呈线性相关，这样就可以通过荧光值得到ATP的含量了。一般来讲，样品中的ATP量是不大的，因此一般情况下是不需要荧光素酶的饱和剂量，这样太浪费试剂，但个别情况下ATP含量奇高，就需要这样作了。我做过几次，实验的可重复性明显好于MTT。在作MTT时由于它的变异度较大，不得不加大样本量，但ATP含量测定其稳定性较好，样本量一般不需要很大，我一般每一个分组有四，五个样品足够了。
网友[jjw703]：
1、台盼蓝染色法，对于悬浮细胞来说，还比较方便，对贴壁细胞来说，较为繁琐。因为要消化，有时，96孔板不一定能消化干净。而且，该法是测定细胞浓度的方法，与细胞悬液的体积有关，加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说，该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰。
2、克隆（集落）形成法，对贴壁细胞来说，较为方便，也较客观。但要注意（1）一定要将细胞充分分散，边摇边加入孔板中；（2）用枪加到孔板时，用力柔和，避免细胞冲到孔板的壁而沉下，导致细胞克隆在孔板的四周较多，中间较少，细胞克隆集中于四周，导致计数误差。
3、MTT法，测定的是细胞浓度，要注意细胞悬液的体积。血清蛋白对实验测定有干扰，要弃上清，加入一定量的SDS或DMSO溶解沉淀物，这两步都会给实验带来误差。而且在96孔上操作，实验孔较多时，加样次数越少越好。所以，该法如斑竹所说，会有误差。
4、CCK－8的实验，只加样一次，实验比MTT法简单，比台盼蓝染色法客观，它的缺点有两方面：
（1）比较贵；
（2）加入CCK8试剂后，一般要放入CO2箱1-2.5小时，保温时间越长，测定A值越高，虽然每一孔的A值都增加了，但不同的孵育时间，测定的IC50还是不同的，但IC50改变不大。
本来细胞浓度测定，测定的细胞浓度是相对值，无论台盼蓝染色法，MTT法，CCK8法都是相对准确的实验，在此意义上，CCK8可以说是比较方便，准确，客观的方法。我们小组的经验是
1、酚红的颜色可能影响实验结果（都是橙黄色），若实验的试剂空白组A大于0.2，则实验体系用无酚红的1640（有售），否则，则不怕/忽略酚红的影响。
2、每次实验，不同孵育时间，A值不一样，以“细胞对照组A＝1.0左右”为最佳孵育时间，每次实验与此统一。
网友[jiyi923]：
给大家介绍一种测定细胞活性的方法，大家可以自己跟MTT比较一下。
原理：Sulforhodamine B （SR）是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的OD读数与细胞数呈良好的线形关系，故可用做细胞数的定量。
材料与方法：
1、其细胞接种与MTT相同。
2、SRB用1%醋酸配成0.4%溶液。细胞在加药培养结束后用三氯醋酸（TCA）固定：贴壁细胞每个小孔加预冷的50%TCA液50ul（终浓度为10%）固定；悬浮细胞每孔加预冷的80%TCA50ul固定，加TCA时必须轻轻加在培养液表面，静置5分钟后再将平板移至4度放置1小时，这样可使悬浮细胞固定在培养孔的底部。
3、倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。
4、每孔加如100ulSRB液，在室温放置10分钟。未与蛋白结合的SRB用1%醋酸液洗5遍，空气干燥。
5、结合的SRB用150ul 10mmol/l非缓冲Tris碱液（ph10.5）溶解。
6、用自动化分光光度平板读数计在515nm波长处测定每个小孔的OD值。
本法用TCA固定细胞后，可随时用SRB作蛋白含量测定，不受测定时间的影响。SRB用tris溶解后也可稳定一个较长的时期。OD与SRB浓度作图时，在OD 单位1.5-2.0间为线性，当超出线形范围时，必须稀释后重新读数。
MTT操作过程中必须吸出细胞培养的上清液，使之比较费时及增加可能的误差，大量使用DMSO也不受欢迎。此外，OD值随时间变化也是一个较大的缺点。当然SRB法操作比MTT复杂一点，但是时间可以自己掌握，不受测试时间的限制。
网友[CindyGloria]：
Trypan Blue 台盼蓝排斥试验，比较适合原代培养的细胞。
原理：
细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。还有其他燃料，如伊红Y和苯胺黑等。
用品：
1. 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。
2. 吸管、血细胞计数板、显微镜
步骤：
1、制备单细胞悬液。并作适当稀释（10 *6 细胞/ml）
2、染色：取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴0.4%台盼蓝溶液，混匀。
3、计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞
结果：
镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。
根据下式求细胞活力：
活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）*100
注意事项：台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。
台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时，细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色，在显微镜下观察即可，活细胞不被染色。方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。
网友[lalala_2004]：
台盼兰染色法价格低廉，操作简单，又不用无菌操作，做这个实验只要是把显微镜调好了，细胞浓度调好了就不会有问题，是一个养细胞的入门实验，所以很适合初学者做。我做这个实验主要是用来确定抑制细胞增殖的药物浓度，排除浓度过大引起的毒性反应。
MTT性价比最高，操作上也不复杂但是也要注意一些地方：
1、刚开始做MTT 实验的时候，结果的稳定性及重复性不好，后来查资料发现，MTT实验的最后OD值要控制在0.75－－1.25之间，这样才能保证数据有线性关系。在先控制好了合适的培养时间和细胞数后，所得到的数据还是令人满意的。
2、一定要保证每孔细胞数相同，这一点很重要，所以一定要充分混匀，边加边吹打，尽快加完。
3、尽量用新的96孔板，同时加样时注意准确，吸弃上清时，尽量小心，不要吸起沉淀，以减小误差。
4、血清浓度对MTT实验也有影响，尽量不高于5％，因为如果蛋白质含量高了，加入MTT反应后会有蛋白沉淀出现，最后的沉淀很难溶。
5、MTT试剂一定要注意避光，如果变绿了，就绝不能用了。
网友[细雨纷飞]：
改良MTT法在细胞活性测定中的应用：
原来的MTT法操作起来比较烦琐，要求技术熟练，但是结果的重复性比较差，因此我们在细胞增殖试验中采用了改良的MTT法，具体步骤如下：
1、细胞接种（96孔板），每孔100μl，细胞量2～5×104个（细胞数量将决定加入裂解液之后的孵育时间）。
2、根据聚体要求进行处理，处理物的量一般为10μl。
3、处理完之后直接加入10μlMTT，继续培养4小时。
4、直接加入裂解液100μl，裂解的时间由接种的细胞量决定，2～5×104个细胞，4小时可充分裂解，如果细胞数目比较大，就要延长孵育的时间。
（裂解液的配比：100ml的N,N-二甲基甲酰胺，100ml蒸馏水，30gSDS（十二烷基硫酸钠）；搅拌待SDS充分溶解之后过滤，过滤得到的液体即可直接应用）
5、裂解完毕之后在振荡器上振荡10min，酶标仪测定。
本方法的方便之处是不要反复吸出液体，减少了操作不当影响结果，每次操作只要直接加入液体就可以了，但是加入的量要按上述说过的量，要不就会溢出孔外，重点是裂解液的配比。
如果要了解的更加聚体，可以参考“改良MTT法检测HEPG-2细胞的增殖”，发表在今年6月份这一期的《卫生毒理学杂志》。
编辑：bluelove
作者: 丁香园集体创作
| 以下网友留言只代表网友个人观点，不代表网站观点 | |||
Copyright 2000-2025 DXY.CN All Rights Reserved