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三、 基因治疗的关键技术

基因载体和导入系统是基因治疗(包括载体疫苗)的关键技术。无论所携带的基因有什么不同，同一种载体构成的基因治疗产品的生产、纯化和制剂过程是一样的。对于病毒载体而言，基因载体和导入系统是合二为一的。以5型腺病毒载体（Ad5）为例，无论其携带的基因是p53还是IL-2，构成的重组腺病毒Ad5-p53和Ad5-IL2的制备和纯化过程是完全一样的。也就是说，这类产品的生产和纯化与其携带的基因无关。对于非病毒载体而言，关键技术还应包括基因导入系统的构建和生产，在生产工艺上表现为对质粒DNA或其它核酸物质的制剂加工。因此，与基因工程产品不同，基因治疗药物的生产过程实质上是基因载体的生产过程。其生产和纯化的方法和工艺以及质量检测方法是由该载体的组装系统及重组载体的物理、化学、生物学特性决定的。掌握一种载体的生产和纯化方法及工艺就意味着掌握了由这种载体介导的一系列相关基因药物产品的生产工艺，因此这种技术具有很强的通用性，在基因治疗产业化发展中的重要作用不亚于军事“隘口”。

1、病毒载体

用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件： 1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒； 2）介导外源基因的转移和表达；3）改造后对机体不致病。

大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面，从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。将其它病毒改造病毒载体的研究工作也不断有报道，比如仙台病毒、麻疹病毒、VSV病毒、流感病毒、乙肝病毒等。

病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。

病毒载体按照基因组组成可以分为2类：

1） 重组型病毒载体：这类载体是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其是立早基因或早期基因，或控制其表达；缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供；用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区；病毒复制和包装所需的顺式作用元件不变。

2） 无病毒基因的病毒载体（gutless vectors）：这类载体的基因组中不含有任何病毒基因，仅含有病毒复制和包装所必需的顺式作用元件。在不同的病毒载体系统中的称谓不同。对于腺病毒，一般称为mini-Ad；在HSV载体系统，一般称为扩增子（amplicon）载体或质粒型载体。重组AAV载体也属于无病毒基因的病毒载体。这类病毒载体的优点在于安全性好，容量大。缺点在于往往需要辅助病毒参与载体DNA的包装，而辅助病毒又难以同载体病毒分离开来，造成最终产品中辅助病毒污染，从而影响其应用。

各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。为了插入较长的外源基因，必须删除更多的病毒基因。除了可以删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去部分或全部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。

    将外源基因包装到病毒壳粒中，是病毒载体生产的核心技术。参与病毒包装的各个要素的集合构成了病毒载体包装系统：

1） 宿主细胞

     宿主细胞不但提供了病毒复制和包装的环境条件，许多细胞成分还直接参与了病毒复制和包装的过程。

2） 病毒复制和包装所必需的顺式作用元件和外源基因的表达盒

    一般地，在组建包装系统时，将病毒复制和包装所必需的顺式作用元件和外源基因的表达盒放在质粒载体上，组成病毒载体质粒，即vector，是被包装的对象。由于病毒复制方式的不同，有些病毒载体如单纯疱疹病毒扩增子（HSV amplicon）载体在包装时，整个载体质粒都被包装进入病毒颗粒中；而有些病毒载体如反转录病毒、腺病毒伴随病毒载体的质粒骨架部分并不被包装到病毒颗粒中，只有病毒复制和包装所必需的顺式作用元件和外源基因表达盒被包装到病毒颗粒中。为了使病毒载体的生产更为方便，病毒复制和包装所必需的顺式作用元件和外源基因的表达盒除了可以用质粒携带以外，也可以用另一种病毒（往往是辅助病毒）或生产细胞来携带。

3） 辅助元件

    包括病毒复制和包装所必需的所有反式作用元件。这些元件一般包括病毒基因转录调控基因、病毒DNA合成和包装所需的各种酶类的基因、病毒的外壳蛋白基因等。辅助元件的表现形式可以多种多样。常用的形式有：

    ① 辅助质粒（helper plasmid），如用于产生重组腺病毒的质粒JM17，用于重组AAV包装的辅助质粒pAAV/Ad（Rolling F and Samulski J 1995）等；

    ② 辅助病毒（helper virus），如用于HSV 扩增子载体包装的辅助病毒HSV1 tsK株；

    ③ 包装细胞系如用于反转录病毒载体包装的PA317细胞。

    这些表现形式之间可以相互转化或合并。例如，辅助病毒可以转化为辅助质粒：传统的AAV载体生产系统常用腺病毒作为辅助病毒。研究发现，并非腺病毒的所有基因对AAV病毒的产生都是必需的，只需要腺病毒E1a, E1b, E2a, E4和VA RNA 5种基因就行了。因此，将这5种基因置于同一个质粒中，构建成的这种新的辅助质粒就完全可以替代原来的辅助病毒，不但提高了包装效率，而且避免了产品中腺病毒污染的问题。

2、 非病毒载体及其导入系统

非病毒载体导入系统的载体部分一般是指质粒DNA，也可以是无载体的核酸，如反义寡核苷酸、Ribozyme、siRNA等。而非病毒载体系统的研究重点和热点更多放在了对其导入系统的组成和工艺方法的探索和发展上。

对于用于基因治疗和DNA疫苗的质粒DNA载体构建的研究进展主要包括以下方面：

1） 将氨卞青霉素抗性基因改为卡那霉素抗性基因。

2） 关注CpG岛的免疫学作用。

3） 同源重组序列或重组酶介导的重组识别序列（如cre/loxP系统）的引入，使载体具有特异位点整合的特点；

4） 其他哺乳动物细胞元件的引入，如基因组复制起点、IR、S/MAR用来增加质粒DNA在哺乳动物细胞内的复制和传代的稳定性。

5） 尽量去除质粒DNA中不必要的序列。事实上，如果能让哺乳动物细胞象细菌一样扩增质粒DNA（准确地称为episome DNA），我们就会完全放弃细菌质粒的骨架部分。

可以用于构建非病毒载体导入系统的物质包括脂类、多糖、多肽或蛋白质、多聚组氨酸或多聚赖氨酸、多价阳离子化合物、类固醇等。研究者们用这些物质不同的组合和配比来构建能包裹于载体DNA或其它核酸物质的“人工外壳”。常见的成分较为单一的非病毒载体导入系统有脂质体、壳聚糖、多价阳离子聚合物如PEI、多聚赖氨酸或组氨酸。更多的是多种成分的复合物，如用多聚阳离子化合物聚集载体DNA；模拟细胞膜的结构成分构成脂质体骨架；加上靶向性多肽以实现导入的靶向性；加入一些病毒来源的多肽如仙台病毒的F蛋白以帮助脂质体与细胞膜融合；加入流感病毒HA蛋白的一个肽段以帮助载体从内吞体中释放等。还有些研究者人工设计含有多个功能域的蛋白，使之既能结合载体DNA，又能折叠成病毒样颗粒（VLP）将载体DNA包裹于其中。许多具有生物相容性的化学合成材料也大有作为。