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三、骨髓瘤细胞的选取

骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。

选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度，最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。

目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO•BU•1；②SP2/0—Ag14（简称SP2，常用）；③P2—X？ ¬—Ag8•6•5•3（简称653）；④FO以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。

骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。

由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。很多书上说为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml 8－氮鸟嘌呤，我个人认为没有这个必要，因为加入8-AG之后，骨髓瘤细胞一般状态都不会很好，这样一来对于融合的影响更大。

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四、关于饲养细胞

在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。

1．材料

（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。
（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。

2．操作方法

（1）拉颈处死小鼠。
（2）70％酒精浸泡消毒10min。
（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。
（4）用注射器将4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。
（5）1000r/min离心10min。
（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。
（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO₂培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。

个人认为取饲养细胞时切忌贪心，别总是想多取一些，因为这样有可能造成一些不必要的麻烦，我又一次取饲养细胞时就曾经将不知是什么血管刺破，导致所取的饲养细胞里面出现大量的红细胞。有人说饲养细胞可以不用，我觉得还是用一点比较好，但是一定不要太多，占到30%就足够了，太多了很影响细胞的观察，而且会导致骨髓瘤等细胞不能很好的贴壁。

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五、取脾脏

融合用的免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞和浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

取脾脏也是一个比较重要的环节，可以说如果出现污染有很大一部分原因是由于融合过程引起的，还有一部分原因就是由于取脾脏这个环节引起的。

取脾脏的要点就是一定要尽量无菌操作，根据实际情况来看，完全无菌是不可能的，但是取脾脏的时候一定要尽量减少操作的时间，主要是研磨这一环节。在研磨之前取脾脏之后，首先要将脾脏上面包被的膜剪掉，这样会节省很多研磨的时间。

脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2×10^８左右。

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