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八、性质检测

对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定：
　
1.　抗体特异性的鉴定：除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。
　
2.　McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3％），将有利于沉淀线的形成。
　
3.　McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。
　
4.　McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。
　
5.　McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。

论坛资源：

求助：单克隆抗体亚型鉴定试剂

单克隆抗体制备中的鉴定用试剂

（请教）单克隆抗体鉴定时必须鉴定IGg亚类吗？有什么意义呢？

关于单克隆抗体的问题

九、后续工作

克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

（一）克隆化方案

用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。

1.　有限稀释法的程序
①　制备饲养细胞悬液（同融合前准备）。
②　阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10^３/ml。
③　取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μl/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
④　培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。
⑤　第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。
注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

2.　软琼脂法
①　软琼脂的配制。
含20％FCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640
1％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。
0.5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
②　用上述0.5％琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
③　按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
④　1ml 0.5％琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
⑤　混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。
⑥　4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
⑦　检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。
　
（二）杂交瘤细胞的冻存
　
及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。
　
杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每个冻存管中含1×10⁶以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一管。
　　
细胞冻存液：
　　50％小牛血清
　　40％不完全培养液
　　10％DMSO（二甲亚砜）

冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃ 后放-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

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（请教）杂交瘤的有效期限

（求助）有关杂交瘤细胞的克隆问题

十、tips

由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。
　　
其主要失败原因和影响因素有：
　　
1.　污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB/c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。
　
2.　融合后杂交瘤不生长
在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素：
①PEG有毒性或作用时间过长。
②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。
③骨髓瘤细胞污染了支原体。
④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。
　
3.　杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体
①　融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。
②　有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。
③　对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。
　　
三要：
　　要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。
　　要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。
　　要定期进行再克隆。
　　
三不要：
　　不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。
　　不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。
　　不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

4.　杂交瘤细胞难以克隆化
可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。


编辑：bluelove