手把手教你作大鼠线栓（MCAO）模型＋灌注取脑＋TTC染色（二）
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网友[雨后天晴]：
说明：因为大鼠线栓模型我们也是跟师兄、师姐学了方法后，自己摸索的，还有很多经验不是很成熟，所以请有经验的战友也积极参与到讨论中来。
可能就是我上面所说的原因，没有实施真正意义上的再灌注。
确实存在这个问题，但我们的感觉是sd大鼠的Willis环解剖结构相对稳定，变异的较少，通过Willis环可以达到再灌的目的。
不过从CCA插线手术相对简单，模型的稳定性不知道怎么样？成功率是多少？
模型还是比较稳定的，关于成功率，不知道您指的是那种？如果是指出现症状的那种，成功率还是很高的，清醒后80%的大鼠都有症状，没有症状的考虑可能是鱼线粗细没选好，或者大鼠的侧枝循环好造成的，偶有鱼线插不进去的时候（早期还不熟练的时候多），但如果加上后期死亡的，成功率就只有50%左右了，死亡原因多是梗死面积大或蛛网膜下腔出血。我们的感觉是再灌后比较兴奋的大鼠一般活不过24h，也曾解剖过一些死亡时间短的大鼠，并进行TTC染色，一般都是大灶梗死或有SAH，这也可能是再灌不够的原因。
我以前做的TTC染色几乎都是皮层缺血，不知道你们为什么是皮层下缺血，可否分析一下原因？
皮层下缺血的比较少见，我们分析可能是鱼线进的深度不够或大鼠侧枝循环好造成的。在我们目前的TTC染色中，也只有这一个是皮层下梗死的，再染好的HE片子中，也只发现了2例皮层下梗死。
其实我们对前囟不是很要求（跟实验设计有关），因为取脑后可在大体标本上见到病灶，我们取材也就区有梗死灶的部位了，一般取视交叉前后的位置，不过我可给您提几个方法：
1、在神经生物板块有大鼠解剖图谱下载，上面好像有前囟的位置（目前我手头没有，所以没发告诉您确切的位置）。
2、看看前几届留下的标本，因为经过福尔马林的浸泡，很容易将皮层和海马分开，一般用手拨开皮层，即可见海马。
3、如下图，可见前囟的位置，在移除颅骨前是否可做个标记呢？
在做博士论文期间，做过几百只WISTAR大鼠MCAO/R，用的都是ECA插线。制作模型的过程是一个熟练的过程，一般来讲，练过20～30只大鼠就应该没有问题了。
关于蛛网膜下腔出血的问题：我在刚开始做的时候，发生率也很高（无论动作如何轻柔），后来我在将鱼线栓线的头端用砂纸磨钝，SAH基本就没有了，感兴趣的战友可以试一下。
网友[雨后天晴]：
先前使用pbs配的，后来就用蒸馏水了，感觉影响不大。
我想应用磷酸缓冲液的目的除了调定PH值以外还可能是为了保持细胞膜的完整性吧。
这位战友提出不同的观点很好，我再解释一下：
1、第一点，出现此结果的可能是栓线可能未完全闭塞MCA末端。这一点我们也考虑到了，并且在我们所有成功的60多只模型中（不包括TTC染色的）只有2只是皮层下梗死的（根据HE染色），请详见我的上一篇回帖。
2、如果从严格的意义和临床的角度讲，缺血再灌注应该从颈外动脉插入栓线，并且拔线时要确保颈总动脉的供血通畅。任何的有关Willis环供血丰富的提法都是没有明确根据的。
关于前一半观点，我们也同意，但我们还是认为从Willis环可以实现再灌的目的，原因是我们在初期也有不少没有成功插线的大鼠，这时其颈总、颈外动脉均已结扎，而且颈内动脉因多次反复插线已形成血栓，不再出血，这种大鼠我们并没有简单的处死，而是养了起来，观察大鼠的术后表现，但根据我们最多5天、最少1天的观察，所有观察的7只大鼠均没有右侧半球缺血的症状（取脑染色后也未见有梗死灶），因此我们考虑Willis环供血丰富的提法是有根据的。
网友[forevermore]：
再灌的目的是使血流再通，因此无论你用何种方法达此目的即可。我用的方法是将在显微镜下将线栓拔至ECA的断端内，保证CCA血流畅通（镜下可以看的很清楚），并保证不出血。当然这样做要增加手术操作时间，而且，如果大鼠未醒可以直接进行再灌，如果再灌时间点较长大鼠已醒则需要追加麻醉：一般来讲1小时之内再灌不用重新麻醉。而且需要再灌的大鼠栓线完毕缝皮的时候只需缝上一针即可，待再灌完毕后再仔细缝合。
另外，如网友所言，大鼠醒后自己会给自己再灌，所以栓线不能留太长，尤其不能留在大鼠创口外面（切记为方便查看，留在创口内的栓线一定要图以与肉色对比较好的颜色）。
编辑：西门吹血
说明：因为大鼠线栓模型我们也是跟师兄、师姐学了方法后，自己摸索的，还有很多经验不是很成熟，所以请有经验的战友也积极参与到讨论中来。
shiqingsun wrote:
CCA插线是比较容易，但是还有很多人从ECA插线，这比从CCA插线难度要大很多，之所以这么做，可能就是我上面所说的原因，没有实施真正意义上的再灌注。不过从CCA插线手术相对简单，模型的稳定性不知道怎么样？成功率是多少？我以前做的TTC染色几乎都是皮层缺血，不知道你们为什么是皮层下缺血，可否分析一下原因？
可能就是我上面所说的原因，没有实施真正意义上的再灌注。
确实存在这个问题，但我们的感觉是sd大鼠的Willis环解剖结构相对稳定，变异的较少，通过Willis环可以达到再灌的目的。
不过从CCA插线手术相对简单，模型的稳定性不知道怎么样？成功率是多少？
模型还是比较稳定的，关于成功率，不知道您指的是那种？如果是指出现症状的那种，成功率还是很高的，清醒后80%的大鼠都有症状，没有症状的考虑可能是鱼线粗细没选好，或者大鼠的侧枝循环好造成的，偶有鱼线插不进去的时候（早期还不熟练的时候多），但如果加上后期死亡的，成功率就只有50%左右了，死亡原因多是梗死面积大或蛛网膜下腔出血。我们的感觉是再灌后比较兴奋的大鼠一般活不过24h，也曾解剖过一些死亡时间短的大鼠，并进行TTC染色，一般都是大灶梗死或有SAH，这也可能是再灌不够的原因。
我以前做的TTC染色几乎都是皮层缺血，不知道你们为什么是皮层下缺血，可否分析一下原因？
皮层下缺血的比较少见，我们分析可能是鱼线进的深度不够或大鼠侧枝循环好造成的。在我们目前的TTC染色中，也只有这一个是皮层下梗死的，再染好的HE片子中，也只发现了2例皮层下梗死。
feiqi wrote:
大鼠脑组织取出来后，我要取前囟后2.0-5.0mm之间的区域（海马所在的位置），怎么在标本上识别前囟，谈谈你们的经验。谢谢你们帮助
其实我们对前囟不是很要求（跟实验设计有关），因为取脑后可在大体标本上见到病灶，我们取材也就区有梗死灶的部位了，一般取视交叉前后的位置，不过我可给您提几个方法：
1、在神经生物板块有大鼠解剖图谱下载，上面好像有前囟的位置（目前我手头没有，所以没发告诉您确切的位置）。
2、看看前几届留下的标本，因为经过福尔马林的浸泡，很容易将皮层和海马分开，一般用手拨开皮层，即可见海马。
3、如下图，可见前囟的位置，在移除颅骨前是否可做个标记呢？
在做博士论文期间，做过几百只WISTAR大鼠MCAO/R，用的都是ECA插线。制作模型的过程是一个熟练的过程，一般来讲，练过20～30只大鼠就应该没有问题了。
关于蛛网膜下腔出血的问题：我在刚开始做的时候，发生率也很高（无论动作如何轻柔），后来我在将鱼线栓线的头端用砂纸磨钝，SAH基本就没有了，感兴趣的战友可以试一下。
网友[雨后天晴]：
silverman wrote:
请问各位，TTC染色的时候为什么要用磷酸缓冲液？我们直接用2%TTC染也能染得上色，但文献上都说要用磷酸缓冲液，这个磷酸缓冲液除了调定PH值以外还有什么作用？？？
先前使用pbs配的，后来就用蒸馏水了，感觉影响不大。
我想应用磷酸缓冲液的目的除了调定PH值以外还可能是为了保持细胞膜的完整性吧。
txj1012 wrote:
根据我博士期间有关线栓法部分的实验，大概做了300多只，有一些结果与楼主不同，并且有一些方法学的问题不同：
1、严格来讲：MCAO模型成功的标志之一是大脑中动脉供血区的梗死，即TTC上皮层及纹状体和部分海马梗死。楼主的方法是正确的，但结果应该给予50分（100分制）。出现此结果的可能是栓线可能未完全闭塞MCA末端。具体可以参考国内外的众多文献。
2、如果从严格的意义和临床的角度讲，缺血再灌注应该从颈外动脉插入栓线，并且拔线时要确保颈总动脉的供血通畅。任何的有关Willis环供血丰富的提法都是没有明确根据的。
这位战友提出不同的观点很好，我再解释一下：
1、第一点，出现此结果的可能是栓线可能未完全闭塞MCA末端。这一点我们也考虑到了，并且在我们所有成功的60多只模型中（不包括TTC染色的）只有2只是皮层下梗死的（根据HE染色），请详见我的上一篇回帖。
2、如果从严格的意义和临床的角度讲，缺血再灌注应该从颈外动脉插入栓线，并且拔线时要确保颈总动脉的供血通畅。任何的有关Willis环供血丰富的提法都是没有明确根据的。
关于前一半观点，我们也同意，但我们还是认为从Willis环可以实现再灌的目的，原因是我们在初期也有不少没有成功插线的大鼠，这时其颈总、颈外动脉均已结扎，而且颈内动脉因多次反复插线已形成血栓，不再出血，这种大鼠我们并没有简单的处死，而是养了起来，观察大鼠的术后表现，但根据我们最多5天、最少1天的观察，所有观察的7只大鼠均没有右侧半球缺血的症状（取脑染色后也未见有梗死灶），因此我们考虑Willis环供血丰富的提法是有根据的。
网友[forevermore]：
ggg345 wrote:
请问拔线的时候是将线全部拔出体外还是拔出一段距离还保留在体内？谢谢！
再灌的目的是使血流再通，因此无论你用何种方法达此目的即可。我用的方法是将在显微镜下将线栓拔至ECA的断端内，保证CCA血流畅通（镜下可以看的很清楚），并保证不出血。当然这样做要增加手术操作时间，而且，如果大鼠未醒可以直接进行再灌，如果再灌时间点较长大鼠已醒则需要追加麻醉：一般来讲1小时之内再灌不用重新麻醉。而且需要再灌的大鼠栓线完毕缝皮的时候只需缝上一针即可，待再灌完毕后再仔细缝合。
另外，如网友所言，大鼠醒后自己会给自己再灌，所以栓线不能留太长，尤其不能留在大鼠创口外面（切记为方便查看，留在创口内的栓线一定要图以与肉色对比较好的颜色）。
编辑：西门吹血
作者: 雨后天晴、pipilulu 等
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