造血干细胞（Hematopoietic stem cells）
人造血干细胞的表型与分离
CD34
CD34是人们认识最早的造血细胞分化标志，也是人们在基础或临床研究中用于造血细胞富集最常用的表面分子。正常人的骨髓有核细胞中，约1-5%为 CD34阳性，脐带血中为1%左右，外周血中低于0.1%。在造血干细胞移植过程中，能使清髓受者多系造血重建的细胞，多数都表达CD34。这种观点已经 在灵长类动物19、受亚致死量照射的免疫缺陷小鼠20和胎羊造血移植9中得到证实。当然，大量的临床自体或异体造血细胞移植，也证明了人CD34阳性细胞 的植入能力21，22。CD34阳性细胞包括所有的LTC-IC、多数CFC和淋巴祖细胞，不含有终末分化的成熟血细胞23-26。肿瘤病人化疗、细胞因 子（尤其是G-CSF）或配合其它化合物，可有效地打破造血细胞与微环境之间的相互作用，使CD34阳性和更成熟的CD34阴性细胞，快速动员至外周血。 CD34阳性细胞动员，以及之后的白细胞分离，已经成为临床造血干细胞移植过程中，收获大量造血干细胞的常用技术27。抗体标记和流式细胞术分析，是计数 CD34阳性细胞的最常用方法，用于监测动员效果，从而确定移植必需的最小有效细胞量。然而，必须指出的是，动员的CD34阳性细胞中，真正的造血干细胞 含量不足0.1%，大多数CD34阳性细胞为单系祖细胞，具有有限的增殖能力，移植后不能或只能短期造血。因此，前面讨论的功能实验对评价动员CD34阳 性细胞的造血潜能，是十分重要的。
利用抗CD34单克隆抗体，借助FACS或免疫磁珠（如EasySep?，RoboSep? 或StemSep?）可以分离纯化人CD34阳性细胞。这种分离方法同样适用于灵长类动物和其它动物种类，只是换用动物相关特异性抗CD34抗体而已。
CD34是人造血干/祖细胞的常用标志。然而，也有证据表明，有一群非常原始的CD34阴性HSC，可以植入NOD/SCID 28-30和胎羊31，并在体内外均可产生CD34阳性HSC。目前已知，这群CD34阴性可重建NOD/SCID小鼠造血的细胞，不表达CD38, c-KIT，FLT3和系列特异性抗原，但表达CD133 32,33。与静脉输注比较，通过直接骨髓内注射该细胞，其NOD/SCID小鼠的植入性得以明显改善，提示CD34阴性HSC较难归巢于造血微环境 34。利用胎羊移植模型进行造血连续移植的研究表明，人骨髓和动员的外周血中相当部分造血干细胞为CD34阴性35。然而，利用NOD/SCID小鼠移植 实验发现，人胎肝造血细胞群体中只有CD34+细胞具有再生能力36。因此，人造血细胞CD34表达远比我们以前的认识复杂多变，在揭示已定表型细胞群体 造血能力时，尤应引起大家的注意。
HSC缺乏系特异性标志
原始造血细胞，包括HSC，不表达终末分化血细胞特有的表面标记。这些表面分子称为系列特异性标志（lineage-specific markers, or Lin markers）。利用Lin标记可以区分造血细胞群体中的幼稚和成熟细胞。用于人造血细胞分离的常用Lin标记包括血型糖蛋白A（红系）、T淋巴细胞表 达的CD2，CD3，CD4和CD8、单核/巨噬和粒细胞表达的CD14，CD15，CD16和CD66b、B细胞表达的CD19和CD20、以及NK细 胞表达的CD56等。利用针对这些分子标记的系列抗体，可通过免疫磁珠法（如EasySep?）或密度梯度离心法（如RosetteSep?），富集骨髓 和其它细胞群中的造血干/祖细胞。通常，阴性筛选可使造血干/祖细胞富集20-500倍。影响富集效果的因素包括：所用系列抗原的组合，细胞群的组成以及 细胞筛除效率。在利用FACS筛选原始HSC或其它亚群之前，Lin标记阴性筛选是一种常用的预富集步骤。通过Lin标记细胞，降低了细胞总数，提高了造 血细胞含量，从而可大大节约筛选时间，提高目的细胞的收获量、纯度和活力。必需指出的是，和纯化的CD34阳性细胞群一样，Lin阴性细胞仍是一种异质性 的细胞群。这群细胞中，不足20%具有集落形成能力，更原始的LTC-ICs 和NOD-SCID 植入HSC含量更少，分别不足1%和0.1% 6,13,19,37。
为进一步富集HSC和原始祖细胞，可再增加一些抗体组合。这些抗体针对的抗原，在90%以上的Lin阴性和CD34阳性细胞（包括LTC-IC和CFC） 高表达，而在大多数HSC表面低表达或不表达。这些针对系列祖细胞的标志分子包括：CD38, CD71, HLA-DR和CD45RA 38-42。CD33是一种高表达于成熟髓系细胞的表面分子，早期报道认为HSC和原始祖细胞上不表达43，但近期的研究提示原始祖细胞和 NOD/SCID重建细胞均表达CD3344。因此，清除CD33阳性细胞不是富集原始造血细胞的理想措施。另外，为富集人HSC和原始祖细胞群，可先清 除Lin阴性细胞，之后通过阳性筛选表达造血细胞特异性标记的某一群细胞，如Thy-1 (CD90), c-KIT (CD117) 或CD133阳性细胞等 45,46。
小鼠造血干细胞的表型和分离
和人造血干/祖细胞一样，小鼠源细胞也可以通过系列特异性标志的阴性筛选进行富集，这些标志包括CD3（T细胞），B220（B细胞及某些NK细 胞），Ly6G/Gr-1（粒细胞），，CD11b/Mac-1（单核/巨噬细胞）和TER119（红系细胞）47。有趣的是，系列特异性标记是通过负筛 选富集小鼠造血干/祖细胞的有效途径，但是，并非所有系列标记适合于从所有组织中富集HSC。例如，胎肝HSC也表达单核/巨噬细胞的标记分子 CD11b48, 49，使用CD11b阴性筛选富集胎肝中的HSC肯定是不合适的。AA4.1 (CD93)是阳性筛选胚胎HSC的良好标记，但不适于成年小鼠HSC的分离纯化49-51。胎鼠和成年小鼠HSC表达SCA1 (Ly-6A/E)， Thy-1和c-KIT 47,52,53，然而，趋于成熟的红系、粒系和巨核系祖细胞表达c-KIT，但不表达SCA1 54。筛选Lin-/SCA1+/c-KIT+细胞(即LSK细胞)是分离小鼠HSC常用的方法。但是，必须注意的是，不同品系的小鼠造血细胞Sca-1 表达量是不同的55。例如，C57BL/6J小鼠Sca-1高表达，而其它品系小鼠，如BALB/c则表达量很低。除利用Sca-1外，也可以用其它标志 或方法分离小鼠造血干/祖细胞。如：依据细胞罗丹明123和Hoechst33342染料排出能力，或正筛选SLAM受体 （CD150），EPCR（CD201）或ESAM阳性细胞等56。小鼠原始造血细胞也表达CD34，但是，小鼠CD34基因表达的调节方式与人不同 57。一般认为，所有的小鼠胎肝源HSC为CD34阳性，幼鼠骨髓细胞中约50%HSC表达CD34 58。然而，成年鼠90%左右的HSC为CD34阴性，成年鼠骨髓LSK细胞群体中，CD34-细胞亚群HSC的含量是CD34+亚群的5倍53。 CD34在小鼠HSC上的表达，不仅与造血细胞发育阶段，也与细胞的活化状态有关59。
因此，即使在成年鼠造血细胞发育过程中，随着造血干/祖细胞的发育分化，CD34反而高表达。CD34常常被认为小鼠晚期造血祖细胞的标志，如定向髓系祖细胞（即common myeloid progenitors, CMPs）54。
编辑: gaowei2010
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