造血干细胞（Hematopoietic stem cells）
小鼠造血干细胞的表型和分离
和人造血干/祖细胞一样，小鼠源细胞也可以通过系列特异性标志的阴性筛选进行富集，这些标志包括CD3（T细胞），B220（B细胞及某些NK细 胞），Ly6G/Gr-1（粒细胞），，CD11b/Mac-1（单核/巨噬细胞）和TER119（红系细胞）47。有趣的是，系列特异性标记是通过负筛 选富集小鼠造血干/祖细胞的有效途径，但是，并非所有系列标记适合于从所有组织中富集HSC。例如，胎肝HSC也表达单核/巨噬细胞的标记分子 CD11b48, 49，使用CD11b阴性筛选富集胎肝中的HSC肯定是不合适的。AA4.1 (CD93)是阳性筛选胚胎HSC的良好标记，但不适于成年小鼠HSC的分离纯化49-51。胎鼠和成年小鼠HSC表达SCA1 (Ly-6A/E)， Thy-1和c-KIT 47,52,53，然而，趋于成熟的红系、粒系和巨核系祖细胞表达c-KIT，但不表达SCA1 54。筛选Lin-/SCA1+/c-KIT+细胞(即LSK细胞)是分离小鼠HSC常用的方法。但是，必须注意的是，不同品系的小鼠造血细胞Sca-1 表达量是不同的55。例如，C57BL/6J小鼠Sca-1高表达，而其它品系小鼠，如BALB/c则表达量很低。除利用Sca-1外，也可以用其它标志 或方法分离小鼠造血干/祖细胞。如：依据细胞罗丹明123和Hoechst33342染料排出能力，或正筛选SLAM受体 （CD150），EPCR（CD201）或ESAM阳性细胞等56。小鼠原始造血细胞也表达CD34，但是，小鼠CD34基因表达的调节方式与人不同 57。一般认为，所有的小鼠胎肝源HSC为CD34阳性，幼鼠骨髓细胞中约50%HSC表达CD34 58。然而，成年鼠90%左右的HSC为CD34阴性，成年鼠骨髓LSK细胞群体中，CD34-细胞亚群HSC的含量是CD34+亚群的5倍53。 CD34在小鼠HSC上的表达，不仅与造血细胞发育阶段，也与细胞的活化状态有关59。
因此，即使在成年鼠造血细胞发育过程中，随着造血干/祖细胞的发育分化，CD34反而高表达。CD34常常被认为小鼠晚期造血祖细胞的标志，如定向髓系祖细胞（即common myeloid progenitors, CMPs）54。
干细胞分离鉴定的新标志和新方法
乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH）
原始造血细胞对烷化剂耐药，这些药物主要包括环磷酰胺和马法兰等60。这种耐药性与细胞高表达ALDH有关61, 62。利用荧光标记的ALDH底物，如StemCell公司生产的ALDEFLOUR试剂，可借助FACS鉴定、分离人和小鼠HSCs 63-65。在人骨髓细胞中，ALDH与CD34的表达是重叠的，FACS筛选的ALDH强阳性（ALDHbright）细胞，即为原始的造血细胞（包括 定向造血祖细胞）。ALDH在人骨髓源Lin-和CD34+/CD38-细胞上表达最高，如果结合系列阴性筛选，可通过分离ALDHbright细胞富集 LTC-IC和NOD/SCID重建细胞；甚至，在临床移植中，ALDHbright细胞也具造血重建能力64-69。人骨髓和脐带血中 ALDHbright细胞中含有极少量的CD34-/Lin-/CD38-细胞；脐带血ALDHbright/CD34-细胞具有NOD/SCID造血重 建能力70。
利用ALDEFLUOR?检测与分离小鼠干细胞，其实用性尚不肯定。有研究认为，小鼠和大鼠神经干细胞表达ALDH 71, 72，但是，小鼠造血细胞的研究结果尚不统一70,73，提示在ALDH表达方面，小鼠和人造血干/祖细胞是不一致的。
旁群细胞
表型和功能研究已经证实，造血干/祖细胞可以将与线粒体和DNA结合的荧光染料罗丹明123和Hoechst33342排出细胞外。流式细胞仪检测时，在 荧光强度和细胞大小为参数的流式散点图上，可以看到很少的Hoechstlow干细胞位于其它分析细胞的一旁，形成独特的流式图像，所以称之为旁群细胞 （side population, SP）。SP细胞在多种种类动物，如小鼠、猴和人的造血组织中存在74。小鼠骨髓中的SP细胞不但可以重建造血，在移植后也可以形成心肌细胞和内皮细胞 75，说明小鼠SP细胞是一群不均一的群体，其中也含有非造血组织干细胞。相反，并非所有的人HSC存在于SP细胞群中。人胎肝NOD/SCID小鼠植入 细胞具有SP特征；然而，在动员的人外周血干细胞中，能快速植入β2微球蛋白敲除NOD/SCID的细胞，绝大多数为非SP细胞76, 77。另外，人脐带血中的CD34-NOD/SCID重建细胞不存在于SP细胞群中70。
SP细胞不表达系列特异性抗原，因此，在FACS分选SP细胞前，可先用阴性筛选的方法去除成熟细胞，使SP细胞富集，从而减少分离这些极少量细胞的时间。
内皮蛋白C受体（CD201）
CD201，亦称内皮蛋白C受体（endothelial protein C receptor, EPCR），曾是鉴定内皮细胞的标志分子78。之后，通过对高度纯化的造血干/祖细胞基因型分析发现，富集的鼠骨髓造血细胞与剩余的细胞相比，前者 EPCR阳性率是后者的40倍左右79-81。从小鼠骨髓纯化的EPCR阳性细胞，具有重建能力的HSC富集程度超过1000倍，而且，与SP细胞相 比，EPCR阳性细胞具有更强的造血干细胞活性80。大约50%的中度表达CD45、罗丹明阴性而同时高表达EPCR的细胞，在受体小鼠中产生多系和长期 的造血重建过程，表明这群细胞几乎是纯的干细胞82。大约30%的胎肝LSK细胞表达EPCR，EPCR 阳性的LSK细胞富含能引起长期造血重建的HSC；同时，EPCR阴性的LSK细胞几乎不具备重建能力83。人造血细胞也表达EPCR，提示EPCR可以 用于人HSC的分离。
SLAM 受体
SLAM家族中的某些分子，尤其是CD48和CD150，是分离小鼠HSC有用的标志。小鼠骨髓和胎肝中的CD48-/CD150+ 细胞是高度富集的造血干细胞和造血原始祖细胞，而更成熟的祖细胞（包括大多数CFC），都是CD48+和CD150-细胞84, 85。有趣的是，与SCA1不同，SLAM表型特征在不同年龄段、不同品系的小鼠之间，是没有变化的86。
CD150可以与其它标记联合使用，如CD45，CD48和EPCR，用于分离不同功能的造血细胞亚群。例如，胎肝和骨髓EPCR+/CD48- /CD45+细胞群中的CD150阳性细胞，代表一群几乎纯化的具有自我更新能力和长期造血重建能力的HSC；而这群细胞中的CD150阴性细胞，则代表 一群具有长期造血重建能力，但自我更新能力有限的造血祖细胞87。
ESAM
最近的研究表明，无论HSC来源于胚胎或成体造血组织，均表达内皮细胞选择性粘附分子（endothelial cell-selective adhesion molecule，ESAM）；相反，定向祖细胞不表达ESAM。对于小鼠HSC而言，ESAM的表达也与LSK和SLAM表达相关。此外，在纯化的骨髓 和脐带血CD34+/CD38-/CD90+细胞中，可以在mRNA水平检测到ESAM；而这群细胞富含NOD/SCID重建细胞，提示ESAM也可以作 为鉴定和分离人HSC的标记56,88。
干细胞工程
目前，造血干细胞移植已经成为治愈白血病、其它恶性肿瘤、骨髓衰竭、血红蛋白病和遗传性免疫系统或代谢性疾病的有效途径。对于其它疾病而言，如自身免疫性 疾病，如能有合适的供者，且预处理毒性、机会感染、植入失败和移植物抗宿主病等严重移植并发症得以控制，造血干细胞移植仍是有益的。造血干细胞移植的安全 性和有效性取决于移植物中干细胞的含量、干细胞归巢于骨髓和脾脏的能力、以及植入的干细胞体内扩增和新生血细胞的功能。例如，脐带血是很好的干细胞移植来 源，对缺乏HLA完全相合的病人而言尤其如此。然而，脐血中具有重建能力的细胞数量极低，移植后粒细胞和血小板恢复延迟，成年人恢复更为迟缓。如能增加移 植物中HSC的数量，促进移植后造血细胞新生，必然会提高脐血造血干细胞移植的实用性。为此，人们正在付出积极的努力，探索实用的新措施。
干细胞扩增
利用化学成分清晰的无血清体系，如StemSpan? SFEM或H3000，在补加细胞因子条件下，培养纯化的造血细胞，可获得大量的CD34阳性细胞、CFC和成熟细胞；然而，在体外条件下，扩增真正的造 血干细胞，以满足造血干细胞移植的需要，是十分困难的。即使在最优化条件下，体系中加入造血早期调控因子如TPO，SCF和FLT-3配体，人和小鼠造血 细胞扩增后，体系中LTC-IC和可移植干细胞的数量只有少量增加，一般不超过4倍8,89,90。然而，借助反转录载体使小鼠HSC过表达 HOXB4，HSC数量可扩增40倍91。如不进行基因修饰，只是在扩增体系中加入HOXB4重组蛋白，HSC数量只轻度增加，但仍可达到4倍扩增效率 92。令人兴奋的是，最近的研究表明，小鼠骨髓细胞过表达核孔蛋白98-HOXB4融合蛋白后，HSC可达到更有效的扩增，达1000至10000倍 93。提高HSC扩增效率的其它措施包括：添加Notch信号途径的配基94、细胞因子组合中加入血管素样蛋白5和IGF结合蛋白2, 95，或与间充质基质细胞共培养等96。
干细胞归巢
增加可归巢造血细胞的数量，也是促进HSC植入的有效措施。基质细胞衍生因子-1（SDF-1）及其受体CXCR4，在干细胞归巢和植入过程中起着十分重 要的作用97。利用小分子物质抑制胞外膜结合的蛋白酶CD26的活性，阻止其降解SDF-1，可促进小鼠Lin-/SCA1+细胞骨髓的归巢和定居，促进 人CD34阳性和Lin阴性细胞植入NOD/SCID小鼠98-100。然而，在临床上，这些措施是否能促进人干细胞归巢，加速病人造血恢复，仍需进一步 研究证实。
细胞因子治疗
注射细胞因子以促进移植后造血细胞体内扩增，也是一种有前途的治疗方案。但是，这种方案仍处于试验阶段。像G-CSF、GM-CSF、SCF和Tpo这些 造血细胞因子，在放化疗后骨髓抑制时注射，可促进内源性造血细胞的再生，有效缩短三系缺乏期。然而，与接受非清髓化疗的病人相比，造血干细胞移植进行清髓 预处理后，细胞因子治疗效果较差，某些病例可能出现副作用，如急性过敏反应和产生细胞因子中和抗体等101, 102。为改善细胞因子的治疗效果，减少副作用发生，必须重新设计细胞因子用量，或使用工程化的细胞因子。此外，根据细胞因子的结构，通过cDNA剪接技 术合成具有细胞因子活性的小分子肽替代物，可改善细胞因子药物特性，降低其毒性和免疫原性等副作用103-105。这些小分子替代物也能改进细胞因子的治 疗效果。
编辑: gaowei2010
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