激光共聚焦显微镜的原理与应用
激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究，神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析 荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究，细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究，胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。
传统的光学显微镜采用的是场光源，因而容易产生散射干扰，使得光学显微镜视场中的图像边缘不清晰，影响图像质量。而LSCM系统则采用点光源以及共聚焦扫描技术，从而实现了独特的功能。
一、基本原理
传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。
LSCM共聚焦的工作原理可通过下图来加以阐明。
在LSCM系统中采用了点光源，由点光源发出的激光光束通过光源针孔, 经二色镜折射至物镜后，聚焦于样品的焦平面上。从样品表面上反射回来的光信号反向并透过二色镜刚好会聚在共聚焦检测孔上，被放置在该位置上的PMT所接收，这样就采集到了从样品的聚焦点上获得的该点的信息。在焦平面上作X或Y轴向的逐点逐线的移动扫描所获得的信息，经计算机储存、处理，即可获得该XY平面的二维图像。由于采用的是非常细的点光源照射样品表面，同一焦平面上的焦点外的光信号虽然也可以同时透过二色镜，可能会聚于检测针孔之前或之后，但不能刚好会聚在检测针孔后的PMT 上，即焦点外的信息不被采集。由于检测针孔和光源针孔是连动的，它们相对于物镜焦平面是共扼的，称为共扼体系。正是这一共轭体系保证了每次的扫描仅能正确地采集到每一焦点内的信息而摈除了焦点外的信息。
另外，显微镜的载物台在微量步进电机的驱动下，可使焦平面沿垂直方向做上下移动。这样，即可在Z轴方向上采集到某一特定厚度内的一系列光学切片。LSCM工作时可以根据研究需要选择不同的扫描方式。如图所示，既可以沿着Z轴扫描得到一系列XY平面，也可以沿着Y轴扫描得到一系列XZ平面。也就是说，在最大深度识别范围内，可以在任意方向上以任意厚度获得一系列反映样品结构信息的平面。借助于计算机的图像处理专用软件，可以将这一系列扫描图像以画面剪辑方式依次显示，以研究三维结构与组织功能的关系，也可以将这些平面图像“堆积”起来，成为立体的三维图像。这就是所谓的三维重建的基本原理。
二、应用范围：
涉及医学、动植物科研、生物化学 、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。
细胞形态学分析（观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；半定量免疫荧光分析）；荧光原位杂交研究；基因定位研究及三维重建分析。
一）细胞的三维重建：
1.细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化
2.生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析
3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学
4.生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态
5.神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布
6.微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构
7.病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、HIV等
8.遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断
二）静态结构检测：原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构，如细胞原位监测核算、远未检测蛋白质、抗体及其他分子、检测细胞凋亡、骨架结构等。
三）动态观察：活体细胞或组织功能的实时动态检测，如实时定量测定细胞内钙变化、测定细胞PH 变化、检测膜电位变化、药物筛选、检测荧光漂白恢复。
编辑: helen
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