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（二）注意事项

（1）柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。

（2）纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。

（3）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。

（4）洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。

（5）上样的体积要小，浓度不宜过高。

（6）加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。

四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化

IgG及IgG亚类

（一）原理

葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B 柱上的IgG或不同的IgG 亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。

（二）操作步骤

用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤）。

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装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡。标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/L pH9.0 Tris 液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。

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加样，一般按25～30mg IgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为<0.02。

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用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用pH4.0；纯化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。

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用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。

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收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。

（三）试剂器材

（1）SPA-Sepharose L-4B （pharmacia）

（2）磷酸缓冲液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3

（3）枸橼酸缓冲液 0.1mol/LpH6.0 0.1mol/LpH4.0   +0.02%   NaN30.1mol/LpH3.0

（4）1mol/L pH9.0 Tris溶液

（5）再生缓冲液：①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸钠含0.5mol/L NaCl调整pH至4.5+0.02%NaN3。