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（三）试剂器材

（1）SPA-Sepharose L-4B （pharmacia）

（2）磷酸缓冲液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3

（3）枸橼酸缓冲液 0.1mol/LpH6.0 0.1mol/LpH4.0   +0.02%   NaN30.1mol/LpH3.0

（4）1mol/L pH9.0 Tris溶液

（5）再生缓冲液：①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸钠含0.5mol/L NaCl调整pH至4.5+0.02%NaN3。

（四）注意事项

（1）SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。方法：先用10倍柱体积0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。

(2)SPA-Sepharose CL-4B亲 合层析法还可用于：①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性；②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；③吸收或纯化免疫复合物。

（3）狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。

五、高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体

从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用TSK DEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快，回收率和得率高 ，而且保持良好的生物学活性。

（一）原理

根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗

脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。

（二）操作步骤

腹水离心10000 g,10min，除去细胞和杂质，在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵

↓搅拌20～30min

离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A（pH8.5,

20mmol/L Tris缓冲液）透析除盐

↓4℃过夜

用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK

DEAE SPW离子交换层析柱

↓

洗脱流速1ml/min

0～1min ：0→5%缓冲液B（20nmol/LTris, Ph 8.5,含2.0mol/L醋酸钠）

1～2 min( 线性梯度洗脱)：5→20%缓冲液B

20～22min：20→0%缓冲液B

↓

洗脱液用紫外280nm进行监测

↓

收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定