李扬秋教授：造血干细胞移植后T细胞免疫重建和相关治疗基础研究
暨南大学医学院血液病研究所
李扬秋
T 细胞免疫重建是造血干细胞移植获得长期成功的一个关键因素。为了预防 GVHD 的发生，部分或全部剔除移植物中的 T 细胞是一种有效的预防措施，尤其是在单倍体造血干细胞移植中 T 细胞的剔除是非常必要的，但也更明显地影响移植后 T 细胞免疫重建。所以，一直以来，伴随造血干细胞移植的一个重要研究内容就是：移植物中选择性 T 细胞剔除，移植后适时的选择性 T 细胞回输，以及如何促进 T 细胞免疫重建，从而使机体达到正常的免疫平衡状态。衡量造血干细胞移植后 T 细胞免疫重建的指标包括 T 细胞亚群的数量和比例、T 细胞对 PHA 或抗原刺激的反应性、T 细胞受体(TCR)基因谱系的分布、TCRVα 和 Vβ 亚家族 T 细胞克隆的重建，以及胸腺近期输出功能的情况，有关 TCR 亚家族 T 细胞和胸腺近期输出功能的检测，是目前最受关注的指标，也是国外多数研究中用于衡量造血干细胞移植后 T 细胞免疫重建的关键指标。
一、TCR 基因谱系分析
TCR 是 T 细胞表面识别抗原的分子，也是 T 细胞产生免疫应答的第一个关键分子。TCR 有 α、β、γ和 δ 四种肽链，以 α/β 和 γ/δ 两种异源二聚体分别表达于 T 细胞表面，外周血中主要以 αβ+T 细胞为主。每种 TCR 链均由其相应的 TCR 基因重排而形成，TCR 基因由可变区(V)、多样区(D)，α 和 γ 基因无 D 区、结合区(J)和恒定区(C)4 部分基因片段组成。在 T 细胞发育过程中，TCR 基因的 V、(D)和 J 区必须发生重排，才能形成功能性 TCR，重排过程由于每种 TCR 具有大量的 V、(D)和 J 区，以及在各区联接之间数量不等的核苷酸(N)插入，形成了多样性和高变化的区域，称互补决定区 3(CDR3)，CDR3 是抗原特异性识别结合的部位。由于不同克隆 T 细胞 TCR 基因所形成的 CDR3 的长度和碱基序列不相同，因此，分析各 TCR亚家族基因的 CDR3 谱型，可确定 T 细胞谱系的多样化。在分析 T 细胞重建中，主要分析 TCR Vα 和 Vβ基因谱系，包括两方面的内容，其一是通过分析其各 Vα 和 Vβ 亚家族的表达情况了解机体外周血中存在的各 Vα 和 VβT 细胞的分布和缺失情况；其二是通过对各亚家族中 CDR3 的长度和序列分析，了解各亚家族中所包含的 T 细胞克隆数量，常用的方法是利用 RT-PCR－基因扫描方法分析 TCR Vα 29 个亚家族或 Vβ24 个亚家族的 CDR3 长度。近期有研究进一步分析了移植后 TCR Vδ 亚家族 T 细胞谱系的变化。
二、胸腺近期输出功能的检测
以往的观点认为，成人胸腺已不具备功能，但近年来系列研究证明胸腺仍存在活化 T 细胞合成的功能，真正了解 T 细胞增殖能力和潜能需要通过了解胸腺的近期功能，即通过了解胸腺在近期输出的初始(naive)T细胞的数量来表示胸腺的能力。目前认为：能够作为 naive T 细胞标志的是信号结合 T 细胞受体删除 DNA环(signal joint T-cell receptor excision DNA circles, sjTRECs)，简称 TRECs。TRECs 是 TCRα 基因重排前必须删除 TCRδ 基因过程中的产物(因 TCRδ 基因座位于 TCRα 基因座中间)，它仍存在于细胞中，为游离基因，并不随 T 细胞的进一步分裂而扩增，故随着 T 细胞的分裂而不断被稀释，因而外周血单个核细胞中TRECs 的含量基本上代表了 TCR 基因初始重排形成功能性 TCR 基因时的初始 T 细胞的含量，可作为胸腺近期输出功能的指标。通过定量分析样本中 TRECs 的数量，计算出一定单位数量 T 细胞中 TRECs 的水平，便可以了解其胸腺近期输出初始 T 细胞的数量，从而了解其胸腺的输出功能，即机体所具备的输出初始 T 细胞的后备力量。
三、移植后 T 细胞免疫缺陷和恢复状况
造血干细胞移植后功能性 T 细胞库的重建不仅仅在于外周 T 细胞数量和功能正常，而且还需要多样化的各 TCR Vα 和 Vβ 亚家族 T 细胞谱系的恢复，不同亚家族和不同克隆 T 细胞因其表面所表达的 TCR 的抗原识别区不同，所执行的功能也各异，这一多样性理论上可以高大 1012，它是抵抗各种病原体和提高移植物抗肿瘤(GVT)或抗白血病(GVL)效应所必需的。以往评估各种移植后免疫功能重建情况主要通过 T 细胞总数、CD4 和 CD8 分类及 CD4/ CD8 比值等。利用 TCR 基因谱系分析提供了确切判断移植后免疫功能重建的量化分析方法，而利用定量分析 TRECs 则进一步了解患者胸腺近期输出功能的恢复情况。
(一) 移植后 TCR Vα 和 Vβ 亚家族 T 细胞恢复情况
各类移植后患者短期内常规免疫参数可能已恢复正常，但 Vα 和 Vβ 基因谱系一般需要较长的时间，部分病人可以延迟到移植后第 5 年才能完全健全。部分研究采用了分析 Vα 和 Vβ 基因谱系的变化情况，两者的变化基本相似，后期的研究多数以分析 Vβ 基因谱系作为了解免疫重建的指标。HLA 相合的未剔除T 细胞的异基因骨髓移植(allo-BMT)受者 TCR 谱系的多样性在移植后 2~3 年可基本恢复正常，而剔除 T 细胞移植后 TCR 谱系复杂性恢复至少延迟 6~12 个月或者表现为更不完全。相比之下脐血移植 TCR 谱系多样化的重建优于 HLA 相合的 BMT。而自体干细胞移植后 Vβ 谱系一般需 6~9 个月才能恢复至移植前的 Vβ谱系复杂水平。但 Vβ 谱系分析发现 auto-SCT 前后相同 Vβ 亚家族的 CDR3 序列基本相同，提示 T 细胞谱系的重建依靠移植物中成熟淋巴细胞的扩增。儿童患者移植后 T 细胞免疫重建的速度可能比成人快一些，有一研究显示利用 CD3+T 细胞剔除，降低预处理强度的单倍体移植治疗 22 例儿童难治性血液肿瘤患儿，在移植后的前 4 个月，患儿的 CD3 细胞总数、TRECs 水平、TCR Vβ 谱系和 NK 细胞水平基本恢复正常，也比应用清髓性移植的患儿恢复得快一些。
而在造血干细胞移植治疗重症联合免疫缺陷(SCID)病人的分析结果可能更具有代表性，有研究报道分析 4 例 SCID 病人移植前后的 TCR 谱系特点，在移植前病人的 TCR 谱系明显异常，移植后 TCR Vβ的多样性明显改善，在移植后 1 个月，所有病人可见非暂时性的 TCR 多样性明显增加，但在 1 例病人中发现仅出现 CDR3 相同的单克隆 T 细胞扩增，该结果提示来自供者的外周血暂时性扩增，而非依赖胸腺的再生成熟 T 细胞。
近期，有研究更进一步分析不同 T 细胞亚群中 TCR Vβ 谱系的重建情况，包括 CD4+、CD8+T 细胞，CD4+CD25+T 细胞等，因为不同亚群的 T 细胞功能不同，所以进一步分析其各自 TCRVβ 亚家族的重建情况，可以获得更为明确和详细的资料，有助于更合理地研究和预防 GVHD 等。有研究比较 CD4+CD25+和CD4+CD25-T 细胞中 TCR Vβ 谱系在异基因造血干细胞移植后的异同，结果显示，在移植后早期，两者的TCRVβ 谱系重建有所不同，在移植后早期 CD4+CD25-T 细胞中，可见较多的 TCR Vβ 亚家族单克隆增殖，而直到移植后 3 年，也未能检测到全部的 TCR Vβ 谱系，在 CD4+CD25+T 细胞中，所能检测到的 TCR Vβ亚家族多一些。
(二)TCR γδ 亚家族 T 细胞恢复情况
由于外周血 T 细胞中 90%以上为 TCRαβ+T 细胞，而 TCRγδ+T 细胞比例很少，后者为非 HLA 限制性T 细胞，近年来，越来越多的研究发现 TCRγδ+T 细胞在移植免疫中发挥重要的作用。故近期在移植后 T细胞免疫重建中，已开始引入了对 TCRγδ+T 细胞亚家族重建情况的分析，但相关的资料不多。有报道在移植后几个月内，TCR Vδ 基因谱系可以完全重建，在一些病例中，TCR Vδ1 在移植后出现优势表达。有研究发现在 44 例移植后病人中，27 例可检测到 TCR Vδ1 的优势表达，而在这些病人中，发生 EBV 相关移植后淋巴细胞增殖性疾病的病人仅有 1 例，因相关的研究提示 TCR Vδ1 与抗原多种病毒(HIV、CMV 等有关)。
(三) 移植后胸腺近期输出功能恢复情况
在造血系统恶性肿瘤患者，骨髓抑制性的化疗已经引起 TRECs 水平明显下降，异基因骨髓移植(allo-BMT)后 1~2 个月表型成熟的 T 细胞已恢复，但在移植后早期，几乎不能检测到 TRECs，直到移植后6 个月才逐渐恢复到可检测水平，移植后 1 年，TRECs 的中位数基本达到成人胸腺的正常水平。 自体造血干细胞移植(ASCT)后胸腺近期输出功能的研究在多发性骨髓瘤患者的报道较多，ASCT 后 100 天，大多数患者可检测到 TRECs，并逐渐增加，这种趋势一直持续至移植后 1 年，此后，其值保持稳定。近期有研究报道 HIV 相关淋巴瘤(HIV+ Ly+)接受 HAART 后，进行大剂量化疗和 ASCT，病人在移植后 12 个月 CD4+T细胞水平恢复，TRECs 水平也逐渐升高。异基因造血干细胞移植后 TRECs 水平的恢复相对较慢，而单倍体干细胞移植后 TRECs 水平恢复相对较快些。
(四) 移植后细胞免疫重建延迟与临床疾病状态移植后早期 TRECs 的低水平与严重的感染密切相关，相关性分析提示移植后伴低水平 TRECs 与高移植相关死亡率和广泛性 GVHD 等有关。此外，有资料显示移植后 6 个月内 Vβ 基因谱系明显受限与患者极易感染的时间窗相一致。
编辑: yang 作者:丁香园通讯员
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