王杰军教授：大规模胃癌组织芯片的构建以及胃癌预后因素的分析
王杰军教授
王杰军教授专题报告
上海市长征医院肿瘤科 王杰军 于观贞 陈 颖 王 喜 潘 军
摘要 目的：探寻组织芯片在胃癌研究中的意义，并初步研究影响预后的临床病理因素。方法：收集1072 例胃癌手术切除标本，利用组织芯片仪构建组织芯片，结合免疫组化，检测P53和PCNA 的表达。并用Kaplan-Meier 分析和多因素Cox 回归等统计方法分析影响胃癌患者预后的相关因素。结果：成功构建了含有1072 例胃癌信息的组织芯片，P53 和PCNA 在胃癌中的表达率显著高于正常组织中的表达，分别为55.1%和89.3%，进展期胃癌中的表达率显著高于早期胃癌中的表达。P53 的过度表达与年龄、男性、贫血、腺癌、分化、浆膜侵犯和淋巴结转移高度相关；而PCNA则与年龄、肿瘤部位、腺癌、分化、浆膜侵犯、淋巴结转移以及TNM高度相关。单因素分析当中，年龄、贫血、肿瘤大小、分化、肿瘤分期、侵犯深度、淋巴结转移、手术方式、切缘、术中输血以及PCNA 均与患者恶性预后相关。而在Cox 回归多因素分析当中，年龄、分化、肿瘤分期、淋巴结转移、手术方式、术中输血以及PCNA与患者恶性预后相关。结论：P53和PCNA 在胃癌的发生和发展的过程中起到重要作用；患者、肿瘤、手术情况和生物学因素在内的综合因素影响了胃癌患者的预后。
The Construction of Tissue Microarrays of Gastric Carcinoma And Analysis ofClinicopathological Prognostic Factors of Chinese Gastric Cancer PatietnsWANG Jie-Jun*, YU Guan-Zhen, CHEN Ying,.
1.Department of Oncology, Chang-zheng Hospital,Shanghai 200070, China; 2. Department of Pathology, Chang-hai Hospital, Shanghai 200433, China
Abstract Objective: To construct tissue microarrays of human gastric carcinoma containing largeproportion of cases and to investigate prognostic factors of gastric carcinoma. METHODS: Clinicaldata of 1072 patients with gastric carcinoma, received radical operation from Jan. 2001 to May. 2005were used to construct the tissue microarrays and analyzed retrospectively. Life table method was usedto analyze survival rate, Kaplan-Meier was used for univariate analysis, and Cox regression model wasused for multivariate analysis. Immunohistochemistry was used to detect the expression of p53 andPCNA. RESULTS: Tissue microarrays containing 1072 cases were successfully constructed. P53 andPCNA was overexpressed in the primary tumor, 55.1% and 89.3%，respectively. Overexpression of P53was significantly associated with age, male, anemia, tumor type, differentiation, gastric wall invasion,nodal metastasis and TNM stage. PCNA overexpression had a significant relationship with age, tumortype, tumor location, differentiation, gastric wall invasion, nodal metastasis and TNM stage. Univariateanalysis showed that age, anemia, tumor size, tumor stage, invasion, nodal metastasis, surgical methods,tumor margin, blood transfusion and PCNA were prognostic factors of gastric carcinoma. Multivariateanalysis showed that age, differentiation, pTNM stage, nodal metastasis, surgical methods, bloodtransfusion and PCNA were independent prognostic factors of gastric carcinoma. CONCLUSIONS:Tissue microarrays provide a useful platform for the scientific research of gastric cancer. P53 andPCNA play a critical role in the development and progress of gastric carcinoma. Age, differentiation,pTNM stage, nodal metastasis, surgical methods, blood transfusion and PCNA are the most significantfactors influencing prognosis of gastric carcinoma patients after radical operation.
世界范围内胃癌的发病率有所下降，国内其发病率已降至第三位，次于肝癌和肺癌。然而其死亡率一直居高不下，处于第二位，仅次于肺癌。根据IARCPress2004年报道2002年中国胃癌人数占到全世界的42%以上，因此胃癌严重威胁人们的身体健康并浪费社会资源。研究影响胃癌患者预后的临床病理因素以及探寻行之有效的研究方法，是十分迫切和必要的。
医学分子生物学技术的发展为胃癌的研究提供了许多非常有效的研究工具，其中组织芯片技术尤为特别，能够在一张芯片上同时检测成百上千组织标本中特定基因的表达，并可以研究其表达与疾病之间的关系，对于疾病的分子诊断、预后指标、治疗靶点、抗体和药物筛选等有重要价值。本研究国内外首次构建了大规模的组织芯片，并结合该芯片初步检测了p53 和PCNA 的表达以及分析了影响胃癌预后的临床及病理因素。
一、 材料和方法
(一) 组织标本
2001～2005年我校病理科存档1072 例胃癌术后的石蜡标本，均为上皮来源，剔除肉瘤、间质瘤、淋巴瘤和内分泌肿瘤等非上皮源肿瘤。病理诊断结果经两名以上病理医师确认。男性474 例，女性195例，最小年龄20岁，最大86 岁，中位年龄59.6 岁，详细临床及病理资料见表1。669例患者具有完整的随访资料，最长随访73 个月，最短1 个月，中位时间为30个月。
(二) 组织芯片构建
首先根据HE切片选取存档组织蜡块，再根据HE 切片确定具有代表性的病变部位(癌旁、癌和淋巴结转移灶)。然后应用组织芯片构建仪(Beecher Instruments， Silver Spring， MD)制备组织芯片。方法如下：应用构建仪器在一个新的空白蜡块(45×20mm)中穿孔(直径2mm)，然后在选取的组织蜡块中穿取组织(直径2mm)，准确放入空白蜡块的小孔内，依次按序操作，直至将所有组织标本种植于另一空白蜡块中，并加以记录。最后应用石蜡切片机进行连续切片，厚度为4μm。每个病例均含有1个癌旁组织和2 个原发灶肿瘤，部分患者含有2-3个淋巴结和/或肝脏转移灶组织，原发癌边缘2cm以上正常黏膜作为癌旁组织。
(三) 方法
抗体来源：鼠抗p53 单克隆抗体(DO-7)和鼠抗PCNA 单克隆抗体购于美国Antibody Diagnostica Inc公司。EnVision 免疫组化试剂盒购自丹麦Dako 公司。免疫组化技术采用EnVision 二步法，PBS 替代一抗作阴性对照。
(四) 结果判断
p53 和PCNA 阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色，定位于细胞核。采用二级计分法，阳性细胞计数：根据阳性细胞所占5 个以上高倍镜视野比例计数，从0 到100。染色强度分类：淡黄色，1 分；黄或深黄色，2 分；褐或棕褐色，3 分。两者计分相乘结果从0(无阳性细胞)到300(100%癌细胞呈强阳性表达)。为了便于比较不同病灶间染色强度，阳性结果根据以上分数分为四类：- ：0 ；+：≤75；++： 75～150；+++：>150。
(五) 统计学处理
SPSS11.0 软件作统计处理。组内变量采用配对χ2检验。单因素生存分析采用Kaplan-Meier 分析，多因素分析用Cox回归。
二、 结果
(一) 组织芯片的构建
我们成功构建了1072例胃癌的组织芯片，共有23 个组织蜡块，每个蜡块切除100-150 张组织芯片，厚度约4-5 微米，每隔20张取一张组织芯片行HE染色以观肿瘤组织是否存在。如图1。
(二) P53和PCNA的表达
P53 和PCNA在胃癌中的表达率显著高于正常组织中的表达，分别为55.1%和89.3%。通过比较早期胃癌和进展期胃癌中两者的表达发现：进展期胃癌中的表达率显著高于早期胃癌中的表达(图2、表2)。
编辑: blue 作者:丁香园通讯员
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