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HTRF术语详解 详细 >>

FRET:指荧光共振能量转移,在供体和受体相互靠得很近时,光子能从一个受激发的荧光团(供体)转移到另一个荧光团(受体),并使后者发出荧光。

HTRF:均相时间分辨荧光,Homogeneous Time-Resolved Fluorescence )是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法。

背景(Background):指在没有加入compound时检测到的信号值。

荧光受体(acceptor):指在荧光团受到激光激发时,能发出特定波长的发射光的基团。HTRF®的能量受体均可为XL665和d2。

HTRF技术的延伸--Tag-lite技术

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发布日期:2011-10-11 16:45 文章来源:Cisbio
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关键词: 丁香园 生物专题 htrf Tag-lite技术 受体分析   点击次数:

一、 检测原理:

Tag-lite是SNAP-Tag与HTRF技术相结合,用来进行活细胞表面受体分析的一种技术。SNAP技术由Covalys公司开发出来,并由NEB公司实现商品化,最终与Cisbio公司合作产生了Tag-lite技术。

SNAP和CLIP是小的融合标签蛋白,可特异地与底物通过苄甲基不可逆共价结合,其底物分别为苄甲基鸟嘌呤(BG)和苄甲基胞嘧啶(BC)。由于底物可与各种染料形成衍生物,这样,通过共价反应,染料就标记到SANP或CLIP上了(见图1)。

SNAP或CLIP可以非常容易地融合到蛋白质的N端或C端,所以我们可以构建SNAP或CLIP与目标蛋白的表达载体。质粒转染、融合蛋白表达后,加入标记了荧光染料的底物,我们可以得到标记了荧光染料的目标蛋白。

在Tag-lite技术中,用pSNAP或pCLIP与编码目标GPCR的基因构建质粒,转染入细胞后,就可表达N端融合了SNAP或CLIP的目标GPCR(见图2)。

底物(BG或BC)与HTRF荧光染料反应形成衍生物,例如与供体(Donor)铽穴状化合物(Lumi4?-Tb)形成衍生物,SANP-GPCR或CLIP-GPCR融合蛋白与其反应,则Tb被标记到GPCR上。加入受体(Acceptor)荧光染料标记的配体,可以进行受体配体结合实验。根据实验目的,HTRF的能量受体(Acceptor)与底物形成衍生物,则Acceptor被标记到GPCR上,可以进行GPCR同源二聚化实验。除此之外,我们还可以进行GPCR异源二聚化实验、寡聚化实验以及内源化实验等细胞表面受体分析。

图1: GPCR-SNAP与Tb穴状化合物结合。表达在GPCR N端的SNAP与底物-Tb的苄甲基反应。

  

图2:SNAP与GPCR在N端形成融合蛋白。首构建编码GPCR和SNAP质粒,然后转染入宿主细胞。
 

二、Tag-lite技术的检测波长

Tag-lite技术利用Tb作为能量供体,其发射光谱见图3。从图中我们可以看出,绿色或红色荧光都可以作为Tb的能量受体。这样一种组合,能够提供更高的信噪比,原因如下:1)Tb穴状化合物具有较长的生命周期,可以时间分辨荧光的模式检测。在这种模式下,所有的自发荧光都不会被检测到;2)作为能量供体的Tb,在520 nm和665 nm的发射信号非常低,而这正是能量受体的检测波长,所以来自Tb的干扰很小。

图3:Tag-lite技术的检测波长
 

三、检测特点和优势

1. 可用于所有GPCR受体配体结合分析的平台,构建的细胞可用于所有功能性检测(见图4),并且可检测受体的二聚化、寡聚化和内源化等等

2. SNAP或CLIP的荧光染料标记的底物不能进入细胞,细胞内部不会有信号产生而对实验产生干扰

3. SNAP和CLIP的底物非常特异,不与其它蛋白成分发生反应,SNAP和CLIP可同时表达在细胞表面

4. 基于HTRF技术,背景低,假阳性率低

5. 均相检测,可用于高通量筛选

6. 可采用肽或非肽类的荧光配体

7. 无放射性,可用于同位素检测的替代技术

图4:抗利尿激素在COS-7细胞中诱导产生肌醇-1-磷酸(IP-One)

分别检测野生型V1A(WT-V1A)和SNAP-Tag-V1A(ST-V1A)诱导表达的情况,其EC50非常相近,表明SNAP融合蛋白不会对GPCR功能产生影响。
 

四、应用领域

活细胞表面受体分析,包括受体配体结合、受体同源二聚化、受体异源二聚化,受体寡聚化、受体内源化检测等等。具体实验方法,可前往Cisbio官方网站查阅更多信息:http://www.htrf.com/technology/tag-lite/protocols/

编辑: cq

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