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FRET：指荧光共振能量转移，在供体和受体相互靠得很近时，光子能从一个受激发的荧光团（供体）转移到另一个荧光团（受体），并使后者发出荧光。
HTRF：均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法。
背景（Background）：指在没有加入compound时检测到的信号值。
荧光受体（acceptor）：指在荧光团受到激光激发时，能发出特定波长的发射光的基团。HTRF®的能量受体均可为XL665和d2。
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HTRF技术的延伸--Tag-lite技术
一、 检测原理：
Tag-lite是SNAP-Tag与HTRF技术相结合，用来进行活细胞表面受体分析的一种技术。SNAP技术由Covalys公司开发出来，并由NEB公司实现商品化，最终与Cisbio公司合作产生了Tag-lite技术。
SNAP和CLIP是小的融合标签蛋白，可特异地与底物通过苄甲基不可逆共价结合，其底物分别为苄甲基鸟嘌呤（BG）和苄甲基胞嘧啶（BC）。由于底物可与各种染料形成衍生物，这样，通过共价反应，染料就标记到SANP或CLIP上了（见图1）。
SNAP或CLIP可以非常容易地融合到蛋白质的N端或C端，所以我们可以构建SNAP或CLIP与目标蛋白的表达载体。质粒转染、融合蛋白表达后，加入标记了荧光染料的底物，我们可以得到标记了荧光染料的目标蛋白。
在Tag-lite技术中，用pSNAP或pCLIP与编码目标GPCR的基因构建质粒，转染入细胞后，就可表达N端融合了SNAP或CLIP的目标GPCR（见图2）。
底物（BG或BC）与HTRF荧光染料反应形成衍生物，例如与供体(Donor)铽穴状化合物（Lumi4?-Tb）形成衍生物，SANP-GPCR或CLIP-GPCR融合蛋白与其反应，则Tb被标记到GPCR上。加入受体(Acceptor)荧光染料标记的配体，可以进行受体配体结合实验。根据实验目的，HTRF的能量受体（Acceptor）与底物形成衍生物，则Acceptor被标记到GPCR上，可以进行GPCR同源二聚化实验。除此之外，我们还可以进行GPCR异源二聚化实验、寡聚化实验以及内源化实验等细胞表面受体分析。
图1： GPCR-SNAP与Tb穴状化合物结合。表达在GPCR N端的SNAP与底物-Tb的苄甲基反应。
图2：SNAP与GPCR在N端形成融合蛋白。首构建编码GPCR和SNAP质粒，然后转染入宿主细胞。
二、Tag-lite技术的检测波长
Tag-lite技术利用Tb作为能量供体，其发射光谱见图3。从图中我们可以看出，绿色或红色荧光都可以作为Tb的能量受体。这样一种组合，能够提供更高的信噪比，原因如下：1）Tb穴状化合物具有较长的生命周期，可以时间分辨荧光的模式检测。在这种模式下，所有的自发荧光都不会被检测到；2）作为能量供体的Tb，在520 nm和665 nm的发射信号非常低，而这正是能量受体的检测波长，所以来自Tb的干扰很小。
图3：Tag-lite技术的检测波长
三、检测特点和优势
1. 可用于所有GPCR受体配体结合分析的平台，构建的细胞可用于所有功能性检测（见图4），并且可检测受体的二聚化、寡聚化和内源化等等
2. SNAP或CLIP的荧光染料标记的底物不能进入细胞，细胞内部不会有信号产生而对实验产生干扰
3. SNAP和CLIP的底物非常特异，不与其它蛋白成分发生反应，SNAP和CLIP可同时表达在细胞表面
4. 基于HTRF技术，背景低，假阳性率低
5. 均相检测，可用于高通量筛选
6. 可采用肽或非肽类的荧光配体
7. 无放射性，可用于同位素检测的替代技术
图4：抗利尿激素在COS-7细胞中诱导产生肌醇-1-磷酸（IP-One）
分别检测野生型V1A（WT-V1A）和SNAP-Tag-V1A（ST-V1A）诱导表达的情况，其EC50非常相近，表明SNAP融合蛋白不会对GPCR功能产生影响。
四、应用领域
活细胞表面受体分析，包括受体配体结合、受体同源二聚化、受体异源二聚化，受体寡聚化、受体内源化检测等等。具体实验方法，可前往Cisbio官方网站查阅更多信息：http://www.htrf.com/technology/tag-lite/protocols/
编辑: cq
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