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HTRF术语详解 详细 >>

FRET:指荧光共振能量转移,在供体和受体相互靠得很近时,光子能从一个受激发的荧光团(供体)转移到另一个荧光团(受体),并使后者发出荧光。

HTRF:均相时间分辨荧光,Homogeneous Time-Resolved Fluorescence )是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法。

背景(Background):指在没有加入compound时检测到的信号值。

荧光受体(acceptor):指在荧光团受到激光激发时,能发出特定波长的发射光的基团。HTRF®的能量受体均可为XL665和d2。

STK类激酶检测实验的一般实验流程

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发布日期:2011-10-18 16:51 文章来源:Cisbio
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关键词: 丁香园 生物专题 htrf STK类激酶   点击次数:

实验原理:

经过多年研发,Cisbio合成了能与STK类激酶反应的单磷酸化位点底物,其另一端则接上了biotin。在biotin端,biotin能与streptavidin- XL665(acceptor)相连,完成标记。而在经过磷酸化之后,该底物便能与抗磷酸化位点的抗体(已标有Donor)结合,从而产品FRET信号。

STK类底物有3种,具体对应的激酶类型请致电腾泉生物或Cisbio的技术支持咨询。


 

实验准备:

1. HTRF KinEASE STK检测试剂盒
      该系列试剂盒含有(以HTRF KinEASE STK1产品为例):
      1) STK Substrate 1-biotin
      2) Streptavidin-XL665
      3) STK Antibody-Cryptate
      4) 5x Enzymatic buffer
      5) HTRF

      2. 实验所需的激酶

      3. ATP

      4. 其他所需试剂(如MgCl2,CaCl2等)
 

一般试验流程(384孔低容量板实验法):

Enzymatic Step
      1. 按试剂盒说明,调制部分HTRF试剂
      2. 添加激酶、ATP、化合物及HTRF试剂(Substrate-biotin)
      3. 室温孵化(Incubation)

      Detection Step      
      1. 添加HTRF试剂(Cryptate conjugates in lysis buffer)
      2. 添加金属离子(EDTA等)及HTRF试剂(STK antibody-EU in EDTA)
      3. 室温孵化(Incubation)约1小时
      4. 送入读板仪读板(read)


 

具体实验背景、实验描述及注意事项,点此下载 protocol进一步阅读。

编辑: cq

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