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1、免疫组化脱片产生的原因？
（1）多聚赖氨酸玻片质量有问题。
（2）组织切的不好，切片机的问题或者切片厚度不均匀。
（3）组织自身有坏死。
（4）片子没烤好，时间短、温度不够。
（5）操作的时候用力甩片会促使粘贴不牢固的组织片脱落。
（6）抗原修复的时候高压时间过长或者放进修复液时手法不好容易导致脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片。
（7）用PBS的时候尽量泡片，不要冲。
2、封闭血清的选择原则是什么？
为了防止组织或细胞切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！实验前应用血清进行封闭。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
免疫胶体金技术
四、免疫胶体金的应用
1、胶体金在光镜水平、电镜水平的应用
直径为3～15 nm胶体金均可用作电镜水平的标记物。最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒进行双重或多重标记。
胶体金用于光镜水平、电镜水平的研究，主要包括：①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养中细胞内抗原的检测。③组织切片中抗原的检测。
2、胶体金在流式细胞仪中的应用
应用胶体金标记的抗体，分析细胞表面抗原。胶体金可以明显地改变红激光散射角，区分不同的标记，能同时进行几种标记。
3、凝集试验
单分散的免疫金溶胶清澈透明。与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒增大、沉降，光散射随之发生变化，溶液的颜色发生变化。
4、免疫印迹技术
用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，与特异性的抗体保温后，再与胶体金标记物温育，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。金免疫印迹技术有相当高的灵敏度。采用免疫金银染色法，灵敏度可低至0.1 ng。
5、胶体金在肉眼水平的应用--胶体金免疫结合试验
根据检测装置的不同可分为金免疫层析试验和金免疫渗滤试验。
1、金免疫层析试验
（1）免疫层析条的组成，有4个组分：⑴吸水纸（加样区）。⑵玻璃纤维膜，膜上吸附着干燥的金标抗体（流动带）。⑶硝酸纤维素膜，膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应的质控物条带（检测带）。⑷吸水纸。以上各组分首尾互相衔接。
（2）免疫层析条制作中须注意的几个问题
微孔滤膜：硝酸纤维素膜有2个特性：较高的蛋白吸附容量和良好的亲水性，应用最多。硝酸纤维素膜的活化：先使硝酸纤维素膜上形成氨基手臂，然后再加入戊二醛在手臂上形成自由醛基，多肽与活化膜的活性基团共价联接。
受体：①与膜材料的结合稳定。②有较高的生物活性，因而有足够的配体捕获容量。③有较高的纯度，以保证检测的特异性。④可流动性。标记或非标记受体以干态吸附于流动带，在流动带加入高效助溶剂，从而使受体具有快速溶解的特性。
（3）反应模式有夹心法、间接法、竞争法
例1 金免疫层析法检测吗啡（竞争法）：
吗啡是鸦片类镇痛药，抑制中枢神经系统。是可待因和海洛因的主要代谢物质，吗啡不经代谢即可排泄。
测定原理：吗啡偶联物和胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体固定于膜上测试区。通过吗啡偶联物和尿液中的吗啡竞争结合金标单克隆抗体，最小检出量300 ng/ml。
结果判定：
阳性（+）：吗啡300 ng/ml以上，质控区出现一条紫红色条带，测试区内不出现紫红色条带。吗啡浓度高于300 ng/ml时，胶体金抗体与吗啡全部结合，从而不与吗啡偶联物结合而不出现紫红色条带。阴性（-）：吗啡在300ng/ml以下。出现两条紫红色条带，一条在测试区内，另一条在质控区内。吗啡浓度低于300ng/ml时，胶体金抗体不能与吗啡全部结合。这样，胶体金抗体在层析过程中会被固定在膜上的吗啡偶联物结合，测试区内会出现一条紫红色条带。无效：质控区未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。
质控区 测试区 流动带
二抗 吗啡偶联物 金标单抗
例2 金层析免疫法测定甲胎蛋白（夹心法）：
甲胎蛋白（AFP）是原发性肝癌的肿瘤标示物，对肝癌的早期诊断、早期治疗具有重要临床意义。AFP单抗A、B，羊抗鼠二抗固定于硝酸纤维素膜上，金标AFP单抗C固定于玻璃纤维素膜上。阴性1条带，阳性2条带， 3条带为强阳性，不出现有色条带为试剂失效。
质控带 阳性 阳性 流动带
羊抗鼠二抗 单抗A 单抗B 金标单抗C
例3 金免疫层析法检测梅毒抗体（间接法）：
胶体金标记的抗人IgG，样品中的梅毒抗体与胶体金标记的抗人IgG结合，沿硝酸纤维素膜移动，在包被有基因重组的梅毒螺旋体抗原结合，出现红色反应线。
质控带 阳性 流动带
抗原 金标抗人IgG
编辑: gaowei2010
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