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1、免疫组化脱片产生的原因?
(1)多聚赖氨酸玻片质量有问题。
(2)组织切的不好,切片机的问题或者切片厚度不均匀。
(3)组织自身有坏死。
(4)片子没烤好,时间短、温度不够。
(5)操作的时候用力甩片会促使粘贴不牢固的组织片脱落。
(6)抗原修复的时候高压时间过长或者放进修复液时手法不好容易导致脱片。此外,用EDTA修复比柠檬酸容易脱片。
(7)用PBS的时候尽量泡片,不要冲。
2、封闭血清的选择原则是什么?
为了防止组织或细胞切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体,造成后续结果的假阳性!实验前应用血清进行封闭。封闭血清一般是和二抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合,否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合,会造成背景。也可以用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能与一抗来源一致。

石蜡切片的酶免疫组化注意事项

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发布日期:2012-07-30 15:43 文章来源:丁香园
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关键词: 免疫组化 技术专题 义翘神州 丁香园 丁香通   点击次数:


一.    石蜡切片在染色过程中出现脱片现象?

一般来说,如果用多聚赖氨酸包被过的片子做正常免疫组织化学染色的话是不会掉片子的。但如果要做抗原修复的话,如果片子处理不好的话是有可能掉片子的。你可以试试一下的方法:

1.一般用APES:丙酮=1:50的处理液来处理片子,处理5min左右,然后水洗,烘干既可用于贴片。如果把水滴再处理好的片子上,水比较聚的话说明片子处理的好。

2.贴片子的时候,展片的时间要把握好,不要太长,否则不利于贴牢。

3.烤片子也很重要,切好的片子最好先不要马上收起来,而是水平至于烘片台上37度两个小时以上,一是水分彻底烘干。然后做染色前最好再在60度烘箱烘1个小时。

4.再补充一点 ,石蜡包埋时,酒精梯度脱水以及浸蜡等一点要充分,这对贴片也有影响。

如果这些导致掉片的因素都已经排除但是片子还是掉的厉害,那么也可能是以下原因造成的:

1、多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的,迈新按说也是不错的,可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子,要好一点。

2、组织切的不好,切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀,或者切片者手法不好等。

3、组织的问题,我用的组织癌症的很多,越是癌症组织有坏死之类越容易脱。

4、没烤好,时间短温度不够之类。

5、操作的时候甩的太猛了,有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩,用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

6、修复的问题:抗原修复的时候高压时间过长了,或者放进100度的修复液时手法不好,咚的一声就丢进去了,这样超容易脱片。此外,用EDTA修复比柠檬酸容易脱片,但是你要用到EDTA的时候也没办法,只有从另外的问题上着手。

此外,一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎,用PBS的时候尽量用泡的,不要冲。基本上把这些方面都注意到了,能改善的尽量改善,脱片可以减少很多。

二. DAB显色后发现切片着色不均匀:如一片着色,一片不着色或染色浅?

着色不均匀可能与你的实验手法有很大关系,可能原因有:

1.切出的片子厚度本身可能就不一样,切出一片厚,一片薄,这样可能造成着色深浅不一。

2.有可能是你 显色液底物加到片子上后没有摇匀,造成局部底物浓度不一致,所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下,使片子上所有区域的底物浓度一致。

3.如果你的片子是中间的染色深,靠近边上的浅,那有可能是你蜡圈画的太小,显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。

编辑: gaowei2010

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