生物工程中的无血清细胞培养
无血清培养基的出现是培养基发展历程上的一个里程碑，其一般是在合成培养基的基础上，引入成分完全明确的或部分明确的血清替代成分，使培养基能满足动物细胞培养的要求，又可有效的克服因使用血清所引发的问题。进入20世纪80年代后，新的无血清培养基不断问世，人们经过研究发现，只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白（fibronectin）、转铁蛋白（Transferrin,TRF）、胰岛素（Insulin）和表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）等，不少细胞即能在无血清供应的情况下生长，尤其是CHO、杂交瘤、骨髓瘤细胞以及BHK21细胞等。某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗体的产量甚至较有血清培养时高出数倍。
目前，无血清培养基的研究有两个方向：一是培养基中不含有任何动物来源的添加组分；二是培养基中不含有不明确的添加组分。依此可以将当前应用较多的无血清培养基归纳为以下四种：
（1)无血清培养基，为一般意义上无血清培养基，用各类可替代血清功能的生物材料配制细胞培养基，如牛血清白蛋白(BSA) 、转铁蛋白、胰岛素等生物大分子物质，以及从血清中提取的去除蛋白质的混合脂类以及水解蛋白等。其特点是培养基中的蛋白含量较高,添加物质的化学成分不明确，其中含有大量的动物来源蛋白。
(2)无动物来源培养基，许多商业公司开发的无动物来源培养基是基于生产重组药物的安全考虑，培养基中的添加组分无动物来源，需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物，这些组分可以保障细胞生长及增殖的需要。
(3)无动物蛋白培养基，培养基完全不用动物来源的蛋白，但仍有部分添加物是来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此类培养基组分相对稳定，但必须添加类固醇激素和脂类前体，并且对培养的细胞是高度特异性的。
(4)化学组分限定培养基，此类培养基是目前最安全、最为理想的培养基，首先可以保证培养基批次间的一致性，其中所添加的少量动物来源的蛋白水解物、蛋白都是成分明确的组份。其特点是培养基的性质明确，有利于进行细胞培养的代谢研究，同时分离纯化也比较方便。
无血清培养基种类：
一、CHO：
CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-γ-半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。
目前已有多种外源基因如人组织性纤溶酶原激活剂（tPA）、人促红细胞生成素（EPO）、乙肝表面抗原（HBsAg）、干扰素γ（IFNγ）、干扰素β（IFNβ）、白细胞介素2（IL2）、凝血因子Ⅷ等在CHO细胞中得到表达。在美国已注册的大约73 种蛋白药物生产中，应用哺乳动物细胞培养的有35 种，CHO 细胞培养的就占27 种，其中包括10种单克隆抗体。
二、BHK：
BHK21细胞是幼年叙利亚地鼠肾细胞（Baby Hamster Syrian Kidney ）。1961 年3 月，I.A.Macpherson 和 M.G.P. Stoker 从一日龄叙利亚地鼠肾分离建株，经过84 天连续培养，获得单细胞克隆细胞，即clone 13 或C13。BHK21 细胞广泛用于增殖各种病毒，已成为制备口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想细胞培养系，应用于口蹄疫疫苗生产，之外还可用于生产狂犬疫苗等其它兽用疫苗。BHK21 细胞染色体分布频率是n＝44，为异双倍体细胞系，4倍体发生率为4％，大多数细胞核型分析为44，XY，-6，-15，6q+，15q+。原始的BHK21 细胞株为成纤维细胞，属于贴壁依赖性细胞，后经无数次传代后细胞可悬浮生长。美国ATCC保存BHK21细胞株，编号为CCL-10，为C13 克隆株。对于BHK21细胞， ATCC 推荐使用的培养方式为：使用含10％胎牛血清的MEM 培养基进行细胞培养，细胞培养温度为37.0°C，细胞培养后使用0.25％胰酶和0.03％EDTA消化细胞，细胞分种比例为1：2－1：10，每周1－2 次细胞传代。主要用于口蹄疫疫苗生产。
三、Vero：
Vero细胞是成年非洲绿猴肾细胞（Adult African Green Monkey Kidney ）。上皮细胞，贴壁依赖性生长。该细胞是日本千叶大学的Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年3月27日从一只正常的成年非洲绿猴肾组织培养出来的。其可增值多种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产疫苗，被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。在非典期间又为研究冠状病毒做出贡献，在医药研究中广泛应用。美国ATCC保存Vero细胞株，编号为CCL-81。对于Vero细胞， ATCC推荐使用的培养方式为：使用含10％胎牛血清的MEM培养基进行细胞培养，细胞培养温度为37.0°C，细胞培养后使用用 0.25% (w/v) 的胰酶和0.53 mM EDTA消化细胞，推荐的细胞分种比例为1：4，传代期间，每周更换培养液2～3次。
Vero细胞可使用方瓶或转瓶进行细胞培养，对于生物制药企业，多使用15L转瓶进行细胞培养。转瓶生产制备Vero细胞的主要问题在于如何避免污染，以及细胞良好生长与传代。与原代细胞以及二倍体细胞比较，Vero细胞更容易控制与培养，由于Vero细胞生长速度较快，可进行大比例分种培养。营养Vero细胞转瓶培养效果的因素较多，比如细胞消化液的选择、细胞培养操作程序的使用，但作为重要的生物制药原材料，细胞培养基对细胞培养效果的重要性得尤为突出。细胞培养基不仅为细胞的生长提供必要的各种营养成分，还为细胞培养提供适宜的环境，而且，在利用细胞进行生物制药时，培养基的成分可直接影响制药产品的质量。Vero细胞可使用多种细胞培养基进行培养，使用的血清含量通常为10%。Vero 细胞经较低浓度的血清适应传代后，可适应低血清浓度而良好的生长，细胞的生长状态和生长速度没有明显影响。
四、MDCK
MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬的肾脏组织分离培育建立，通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞。犬肾上皮连续细胞系MDCK (Madin-Daby canine kidney cells) 广泛用于多种病毒的扩增和纯化，如：呼肠孤病毒(Reovius)、腺病毒(Adenovirus)、犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)、猫粒细胞缺乏症病毒(Feline panleukopenia virus，FPLV)及禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)等。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)被公认为最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的3种细胞系之一。传统的MDCK细胞培养大多采用有血清贴壁培养方式。血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂混合物，其含有细胞生长所需的生长因子、激素、载体蛋白、贴壁因子、微量元素 以及其他营养物质，可以有效地促进细胞生长和产物表达。然而，血清的应用也存在许多问题：易受病毒、支原体或其他病原体的污染；批间差异造成产品批 次间的质量难以严格控制；大量血清蛋白的存在增加了下游分离纯化的难度，部分蛋白难以通过分离纯化手段彻底去除，影响了产品的最终质量；此外，血清 来源困难、价格昂贵，大规模动物细胞培养过程中使用血清将会大大增加生产成本。
编辑: gaowei2010
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