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兔单抗亲和力和灵敏度更高
相对于鼠单抗(解离常数Kd在10-9-10-10M水平),兔单抗的亲和力可提高100-1000倍(Kd在10-10-10-12M水平)。实际使用时,兔单抗的工作浓度更低,灵敏度更高,因此产生的背景更低,大大降低了假阳性的发生。用作免疫组化等用途时,有时甚至可免去抗原修复的步骤。

兔单抗能识别更多表位
很多蛋白在人类和啮齿动物中同源性很高,这些保守表位在小鼠体内免疫原性很弱,不容易产生高质量抗体。而兔做为宿主,可以更好地识别这些表位,产生针对更多表位的抗体。当然,兔也适合生产针对鼠类蛋白的抗体。

抗体的制备方法与原理

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发布日期:2012-04-26 09:51 文章来源:丁香园
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关键词: 丁香园 丁香通 生物专题 义翘神州 抗体   点击次数:

一、抗血清的制备

有了质量好的抗原,还必须选择适当的免疫途径,才能产生质量好(特异性强和效价高)的抗体。

(一)用于免疫的动物

作免疫用的动物有哺乳类和禽类,主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等,实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量,如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清,多用家兔和山羊,因动物反应良好,而且能够提供足够数量的血清,用于免疫的动物应适龄,健壮,无感染性疾患,最好为///雄性,此外还需十分注意动物的饲养,以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔,最好用纯种新西兰兔,一组三只,兔的体重以2~3kg为宜。

(二)免疫途径

免疫途径有多种多样,如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等,一般常用皮下或背部多点皮内注射,每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性,如激素、酶、毒素等生物学活性抗原,一般不宜采用静脉注射。

(三)佐剂

由于不同个体对同一抗原的反应性不同,而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱,因此常常在注射抗原的同时,加入能增强抗原的抗原性物质,以刺激机体产生较强的免疫反应,这种物质称为免疫佐剂。

佐剂除了延长抗原在体内的存留时间,增加抗原刺激作用外,更主要的是,它能刺激网状内皮系统,使参与免疫反应的免疫活性细胞增多,促进T细胞与B细胞的相互作用,从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。

常用的佐剂是福氏佐剂(Freund adjuvant),其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份,羊毛脂与石腊油的比例,视需要可调整为1:2~9(V/V),这是不完全福氏佐剂,在每毫升不完全佐剂加入1~20mg卡介苗就成为完全佐剂。

配制方法:按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内,用超声波使之混匀,高压灭菌,置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合,用振荡器混匀成乳状,也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨,均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液(其中加卡介苗3~4mg/ml或不加),加完后再继续研磨成乳剂,滴于冰水上5~10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原,亦可用一注射器装抗原液,另一注射器装佐剂,二者以聚乙烯塑料管连接,然后二者来回反复抽吸,约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。

(四)免疫方法

抗原剂量,首次剂量为300~500μg,加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每2~3周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂,首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml,加强免疫时不必注射百日咳疫苗。

在第2次加强免疫后2周,从耳缘静脉取2~3ml血,制备血清,检测抗体效价(见后)。如未达到预期效价,需再进行加强免疫,直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时,即可放血制备抗血清。

(五)抗血清的采集与保存

家兔是最常用以产生抗体的动物,因此这里主要讨论兔血的收集。羊等较大动物以颈静脉、动脉取血,鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法,一是耳缘静脉或耳动脉放血,一是颈动脉入血,也可心脏采血。取动脉或静脉放血时,将兔放入一个特造的木匣或笼内,耳露于箱(笼)外,也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛,用少许二甲苯涂抹耳廓,30s后,耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖,以单面剃须刀或尖的手术刀片,快速切开动脉或静脉,血液即流出,每次可收集30~40ml 。然后用棉球压迫止血,凝血后洗去二甲苯。二星期后,可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉放血时,将兔仰卧,固定于兔台,剪去颈部的毛,切开皮肤,暴露颈动脉,插管,放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。

收集的血液置于室温下1h左右,凝固后,置4℃下,过夜(切勿冰冻)析出血清,离心,4000rpm,10min。在无菌条件,吸出血清,分装(0.05~0.2ml),贮于-40℃以下冰箱,或冻干后贮存于4。C冰箱保存。

(六)抗血清质量的评价

在免疫期间,不仅各个不同的动物,而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化,因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后,才可使用所取得的抗血清。

1.效价  抗血清的效价,就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是放射免疫法,此法对所有的抗体均适用。某些由大分子(如蛋白类)抗原所产生的抗体,可用双扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。

(1)放射免疫法: 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合,孵育24h后,测定其结合率。通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1:15000,则该血清的效价就是1:15000。抗血清的效价,除由抗血清本身的性质决定外,还受标记抗原的质量、孵育时间,所用稀释液的成分及其pH等因素的影响,在工作中必须引起注意。(测定方法见第8章 )

(2)双向扩散法:利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散,两者在相交处产生沉淀线,以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。

球脂板的制备:100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内,于水浴中加温,搅拌,使琼脂完全溶解,趁热用纱布过滤,待溶液冷却到65℃左右时,加入叠氮钠(NaN3),使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上,约3mm厚,待其冷却,完全凝固后,用打孔器打孔。中央孔内加适量抗原(容量为50μl),周围各孔内分别加入50μl 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32及不稀释的抗血清,37℃下孵育24h,观察有无沉淀线产生,以判断血清的稀释度。

 

编辑: wangminchao

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